保正版！轮状病毒VP7基因植物表达技术研究李余先 著9787122392350化学工业出版社

轮状病毒（Rotavirus）引起的感染是世界范围内导致婴幼儿或幼畜病毒性腹泻的主要原因。据统计，在发展中国家中因轮状病毒感染而导致儿童肠胃炎和脱水死亡达到（60～80）万人/年。人或动物受到轮状病毒感染后，目前还没有有效的治疗手段，利用葡萄糖等虽可暂时性补充腹泻引起的体液水平下降，但无法从根本上消除病毒的危害，由此而造成的社会影响与家庭经济负担巨大。因此，研制一种安全而高效的轮状病毒疫苗，是保护人类健康的迫切需要。

本技术所述人轮状病毒株外壳蛋白VP7 基因序列（HRVVP7）源自专利（US 7285280B1），并针对大肠杆菌密码子偏好性设计合成HRVVP7 基因序列，构建原核表达载体pET-22b-HRVVP7，在大肠杆菌 BL21（DE3）中获得成功表达。HRVVP7 蛋白在包涵体和可溶性部分中，都有不同程度的表达，优化BL21（DE3）诱导表达条件，确定诱导温度30℃、诱导时间9h、IPTG（异丙基硫代半乳糖苷，isopropyl β-D-thiogalactoside）诱导浓度1.0 mmol/L，为可溶性蛋白表达的条件。镍-琼脂糖凝胶FF 柱亲和色谱法纯化获得纯化的HRVVP7 蛋白，为后续植物表达水平检测提供标准品蛋白。针对拟南芥密码子偏好设计合成HRVVP7-linker-CTB 基因，以其为模板通过PCR（聚合酶链式反应）方法获得优化的HRVVP7 核酸序列，成功构建植物表达载体pPhaP3301-HRVVP7-linker-CTB 和pPhaP3301-HRVVP7；农杆菌介导侵染拟南芥，草铵膦筛选获得阳性转基因拟南芥植株；蛋白免疫印迹和酶联免疫吸附实验检测和定量获得高表达量的T3 代转基因拟南芥种子。

为探索植物反应器多种途径生产HRVVP7，本技术利用红花组织培养技术，通过农杆菌介导转化pPhaP3301-HRVVP7 至红花子叶中，对成活植株进行PCR（聚合酶链式反应，又称聚酶链式反应）验证，阳性植株收获种子后继续扩繁，收获T3 代稳定遗传的转基因红花种子，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白免疫印迹对HRVVP7 蛋白进行检测和定性，利用酶联免疫吸附剂测定定量分析，为植物生产轮状病毒疫苗提供新的可行途径。

利用含有HRVVP7-linker-CTB 与HRVVP7 转基因拟南芥种子，提取可溶性总蛋白，经含量测定后免疫小鼠，分析所制备植物疫苗的免疫效果。HRVVP7-linker-CTB 与HRVVP7 转基因拟南芥种子蛋白样本，免疫组小鼠均能产生唾液、粪便、小肠黏膜IgA 抗体与血清IgG 抗体；血清IgG 抗体具有较好的病毒中和能力；HRVVP7-linker-CTB 与HRVVP7 转基因拟南芥种子蛋白，免疫小鼠能够被动免疫子代小鼠；HRVVP7 融合CTB 蛋白在动物免疫实验中表现出优于HRVVP7 蛋白的效果。

本技术首次在拟南芥及红花中表达了HRVVP7（US 7285280B1）基因，比较了融合CTB 前后免疫效果的差异，为植物生物反应器生产轮状病毒亚基疫苗奠定了基础。

吉林农业科技学院

李余先

2021年6月

第1 章　轮状病毒研究概况　1

1.1  轮状病毒的危害 3

1.2  轮状病毒的基本特性  4

1.3  轮状病毒蛋白特征  5

1.4  轮状病毒的血清学分类  8

1.5  轮状病毒疫苗的发展概况  9

1.6  轮状病毒疫苗的效果和有效性  15

第2 章　植物生物反应器生产药用蛋白研究进展及霍乱毒素B 亚基（CTB） 与连接肽介绍　17

2.1  植物生物反应器生产药用蛋白概况 19

2.2  植物生产药用蛋白的优势和面临的挑战 24

2.3  植物生产药用蛋白的技术平台  27

2.4  植物生产疫苗  31

2.5  霍乱毒素 B 亚基（CTB）与连接肽  39

第3 章　轮状病毒外壳蛋白VP7 在原核中表达的研究　43

3.1  原核表达材料和仪器设备  45

3.2  HRVVP7 基因序列合成及克隆载体构建  51

3.3  构建 pET-22b-HRVVP7 原核表达载体 55

3.4  HRVVP7 原核表达条件优化及表达产物的存在形式  61

3.5  十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳检测  64

3.6  HRVVP7 纯化  65

3.7  免疫印迹法检测  66

3.8  基因序列合成及克隆载体构建结果 67

3.9  pET-22b-HRVVP7 原核表达载体构建结果  72

3.10  HRVVP7 原核表达条件优化及表达产物的存在形式结果  73

3.11  HRVVP7 纯化结果 75

3.12  蛋白免疫印迹检测结果  77

第4 章　拟南芥表达轮状病毒外壳蛋白VP7 的研究　83

4.1  拟南芥表达实验材料及仪器准备 86

4.2  构建pPhaP3301-HRVVP7-linker-CTB 和pPhaP3301-HRVVP7 植物表达载体  90

4.3  转化拟南芥与筛选  97

4.4  转化拟南芥的分子生物学检测  101

4.5  HRVVP7-linker-CTB 核酸序列合成及优化结果  103

4.6  PCR 扩增 HRVVP7 核酸序列结果  105

4.7  pEASY -T1-HRVVP7 载体构建结果 107

4.8  构建pPhaP3301-HRVVP7-linker-CTB 和pPhaP3301-HRVVP7 植物表达载体结果  107

4.9  农杆菌的转化及鉴定  110

4.10  拟南芥阳性植株的筛选  111

4.11  转基因拟南芥在转录水平上的表达分析  113

4.12  十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果  114

4.13  蛋白免疫印迹检测结果  115

4.14  酶联免疫吸附剂测定分析外源蛋白的表达量  116

第5 章　红花种子表达轮状病毒外壳蛋白VP7 的研究　123

5.1  红花表达实验材料及试剂准备  125

5.2  pPhaP3301-HRVVP7 质粒冻融法转化农杆菌  127

5.3  红花的遗传转化  127

5.4  抗性苗嫁接  128

5.5  转基因植株的基因组 PCR 鉴定  129

5.6  BCA 法测定红花种子中总蛋白浓度  130

5.7  十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳检测红花种子中 HRVVP7 蛋白的表达  131

5.8  蛋白免疫印迹检测红花种子中 HRVVP7蛋白的表达  131

5.9  酶联免疫吸附剂测定检测红花种子中HRVVP7 蛋白的表达水平 132

5.10  转基因红花苗的获得  132

5.11  转基因红花叶片 PCR 检测结果 133

5.12  BCA 测定总蛋白 134

5.13  十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳检测种子蛋白表达结果  135

5.14  蛋白免疫印迹检测种子蛋白表达结果  136

5.15  酶联免疫吸附剂测定检测种子蛋白表达水平  137

第6 章　转基因拟南芥种子的免疫学检测　141

6.1  免疫检测实验材料及仪器准备  143

6.2  转基因拟南芥植株总蛋白量测定  145

6.3  动物免疫 146

6.4  小鼠产生 HRVVP7 抗体效价测定 146

6.5  抗体中和实验  148

6.6  乳鼠攻毒实验  149

6.7  数据统计与分析  150

6.8  转基因拟南芥种子总蛋白提取与蛋白含量测定  151

6.9  小鼠免疫后产生 HRVVP7 抗体效价测定  153

6.10  HRVVP7 抗体中和病毒效果分析  158

6.11  乳鼠攻毒后观察统计  160

参考文献　169

附录　轮状病毒相关知识简介　183

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