神经形态学图谱

第一章　传统神经形态学染色技术　1

第一节　形态学染色技术的基本原理　2

第二节　传统形态学染色技术的常用方法　2

第二章　传统神经形态学染色技术的结果　9

第一节　周围神经系统的染色　10

第二节　中枢神经系统的染色　42

第三章　神经纤维束路示踪技术　107

第一节　神经纤维束路示踪技术的基本原理　109

第二节　神经纤维束路示踪技术的常用方法　110

第四章　神经纤维束路示踪技术的结果117

第一节　逆行示踪剂标记　118

第二节　顺行示踪剂标记　147

第三节　荧光素示踪剂标记　155

第四节　活病毒示踪剂标记　167

第五节　神经束路示踪技术的综合应用　181

第五章　化学神经解剖学技术　195

第一节　神经活性物质及其受体　196

第二节　化学神经解剖学技术的基本原理　199

第三节　免疫组织化学技术　200

第四节　原位杂交组织化学技术　203

第五节　受体定位技术　205

第六节　神经科学研究技术的综合应用　205

第六章　化学神经解剖学技术的结果　207

第一节　免疫组织化学染色　208

第二节　免疫荧光组织化学染色　219

第三节　免疫荧光组织化学多重染色　236

第四节　转基因小鼠标记结果的免疫荧光组织化学染色　258

第五节　原位杂交组织化学染色　265

第六节　免疫组织化学技术的综合应用　273

第七章　电子显微镜技术　283

第一节　透射电镜技术　285

第二节　免疫电镜技术　286

第三节　冰冻蚀刻技术　290

第四节　冷冻电镜技术　291

第五节　扫描电镜技术　292

第八章　电子显微镜技术的结果　293

第一节　神经系统正常超微结构　294

第二节　神经纤维联系示踪结果的超微结构　316

第三节　免疫组织化学反应阳性染色结果的超微结构　325

第四节　综合方法显示神经纤维联系及其化学性质结果的超微结构　347

第五节　其他电镜观察技术显示的神经组织超微结构　358

主要参考文献　377

缩写词及中英文对照表　381

第一章传统神经形态学染色技术

 神经形态学图谱

 欲对生物组织进行观察和研究，需要一系列的专门技术，其中包括将体积小而厚度薄的生物组织直接染色或将体积大而厚度厚的组织先切片、再染色的组织学染色技术。

 第一节形态学染色技术的基本原理

 神经系统（nervous system）由神经组织（nerve tissue）构成。经过前期灌注、固定、包埋、切片等处理过程的神经组织切片，在显微镜明视野下观察通常是乳白色或淡黄色（图1-1A），在荧光显微镜下观察通常是暗黑色，无法区分拟观察和研究的结构，如神经元、神经胶质细胞、血管等，所以需要进行染色（staining）。染色的目的就是将拟观察的目标物，如神经元、神经胶质细胞、血管等，通过多种手段用特殊的颜色变化比较特异性地标示出来，才能用肉眼或各种显微镜进行观察（图1-1B）。这个过程叫作可视化（visualization），也是神经形态学染色技术的基本原理。

 第二节传统形态学染色技术的常用方法

 神经组织是人体组织的重要部分之一。由于神经组织的结构和功能比较复杂，用常规方法常常染不出或看不到想要观察的结构，因此，神经组织学染色技术往往有别于人体其他组织的染色技术，必须靠特殊的处理和染色方法，才能将神经组织的各种成分充分地显示出来。神经组织内可显示的成分较多，如尼氏体（Nissl body）、髓鞘、变性髓鞘、神经纤维、神经末梢、神经胶质细胞等，这些都要靠特殊的染色方法，才能显示出来。

 19世纪中叶，神经解剖学已逐渐趋向形成一门独立的学科。当时正处于化学工业兴起的时代，早期的解剖学家把化学染料引入神经组织的染色，以显示神经组织的不同成分，为人们认识脑的复杂结构找到了探索的途径。当时，出现了多位杰出的神经形态学专家，他们创建了许多新的神经组织染色方法。这些方法不仅为全面认识脑的构造提供了可靠的手段，而且为现代神经解剖学的形成奠定了坚实的基础。他们留下的宝贵遗产，在今天仍有很高的价值。本章主要展示传统神经形态学染色技术的染色结果。为了便于大家更好地了解传统神经形态学染色技术，首先概要介绍这些染色技术的基本原理、主要用途及其优缺点等。

 一、高尔基染色法

 卡米洛 高尔基（Camillo Golgi，1843—1926），意大利人，1873年发表了题为《脑灰质结构》的短文，文中介绍了他经过长时间探索而发现的一种用金属浸染神经组织的染色方法，即高尔基染色法（Golgi staining method）（图1-2A）。此法将神经组织在重铬酸钾溶液中固定，并以硝酸银沉着于神经组织而使之显示黑色，简称“黑色反应”。但该染色的详细机理及其反应产物的构成、为什么只有极少数的神经元被镀染、哪些类型的神经元可被染出等问题，至今尚未被完全阐明。高尔基染色法能充分显示神经元胞体及其突起，便于清楚地观察神经组织的成分，故该染色法是神经解剖学研究的重要手段之一，也成为开启现代神经生物学大门的一把钥匙。高尔基对细胞学领域的贡献颇丰，高尔基器（Golgi apparatus），高尔基I、II型神经元等都是他发现并以他的名字命名的。

 高尔基染色法的特点是在一张切片中把只有百分之几的神经元镀染出来，借此可以观察到完整的神经元轮廓及突起的走行方向。在显示核团的内在组合（intrinsic organization）或研究轴突和侧支的走行方向等方面，曾经是优越的方法。即使在各种标记法盛行的今天，该法仍未失去其在神经元形态和联系研究中的重要地位。该法的缺点是染色结果不稳定、随机性强、染色技术不易掌握等。现在常用的单细胞内注入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、生物胞素（biocytin）或荧光素[如童虫黄（lucifer yellow）]、基因重组活病毒（gene recombination live virus）标记等方法都能比较完整地显示整个神经元形态，有人将其称为新_尔基染色法。

 在1870～1900年，高尔基以坚韧不拔的精神，为神经解剖学的发展作出了不可磨灭的贡献。1906年，他和卡哈（Cajal）共同获得了诺贝尔生理学或医学奖。

 二、卡哈染色法

　圣地亚哥 拉蒙-卡哈（SantiagoRamon y Cajal，1852一1934），西班牙人，被誉为神经科学之父，他既是神经组织学家，又是优秀的摄影家，擅长绘画。1887年，卡哈初次见到高尔基染色法和维格特-珀尔染色法（Weigert-Pal staining method）染出的结果时，即深受感染，从此开始了他的神经解剖学研究生涯。首先，卡哈改进了高尔基染色法，他将神经组织在固定液中浸泡了更长的时间，并用重铬酸钾或锇酸进行处理，再将组织投入到低浓度硝酸银中，生成棕色的铬银沉淀，使染色结果更加稳定。其次，他将染色后的组织用火棉胶或石蜡进行快速包埋，切成厚片，使之随即就可在显微镜下直接观察。卡哈改良的高尔基染色法已经成为镀银染色的经典技术之一，至今仍在使用。

 卡哈将照相技术引入神经组织的染色中，在高尔基染色法的基础上，他于1903年创立了以他自己名字命名的还原硝酸银染色法，即卡哈染色法（Cajal staining method）。此法是由斯皮尔迈尔染色法（Spielmeyer staining method）与毕晓夫斯基染色法（Bielschowsky staining method）演化而来，可以镀染神经元内的“神经原纤维”（neurofibril），从而达到通过显示树突棘及轴突末梢与其他胞体之间联系状态观察神经组织细微结构的目的。与高尔基染色法不同，卡哈染色法首先借助神经细胞的嗜银性，用硝酸银浸透整个组织，然后通过焦性没食子酸、对苯二酚或甲醛将细胞内的银离子还原为金属银颗粒，即可在显微镜下观察到深染的神经细胞，故该法又叫作“还原银法”，是一种至今仍在使用的经典方法。经过卡哈染色法染色后，尽管低倍镜下看整个细胞像充满了棕黑色物质，但在高倍镜下显示的却是精细的神经原纤维结构。此外，卡哈染色法还可以显示切片上所有细胞。借助这套方法，卡哈及其同事仔细研究了成体及胚胎时期神经组织的细胞构筑，提出了“神经元学说”、神经细胞的“动态极化定律”等理论;他们的成果构成了现代神经生物学的基础。今天，权威教科书上的大部分神经组织形态学知识就是在那个时候积累起来的。与高尔基染色法只能随机地染出神经组织中的部分神经元不同，卡哈染色法可以比较清楚地观察到染色神经组织中几乎所有的神经元，尤其是对体积较大和突起粗长神经元的染色效果较佳。这对于比较不同实验组别的不同动物的染色结果来说，卡哈染色法无疑具有自身的长处。

 卡哈为神经解剖学留下了丰富的遗产。自从卡哈染色法使用之后，人们才开始以细胞形态来划分神经元的种类，比如，将大脑新皮质的神经元依据其形态划分为锥体细胞（pyramidal cell）、颗粒细胞（granular cell）和梭形细胞（fusiform cell）三大类，他的巨著《人和脊椎动物神经系统组织学》和《神经系统的变性和再生》，已成为神经科学领域的经典著作。

 三、尼氐染色法

 弗朗茨 尼氏（Franz Nissl，1860—1919），德国病理组织学家，1892年创立了尼氏染色法（Nissl staining method）。该法常用的碱性染料有甲酚紫（cresol violet，也称焦油紫或克紫）、硫堇（thionine）、甲苯胺蓝（toluidine blue）等，它们既可结合核糖核酸（RNA）或脱氧核糖核酸（DNA）或粗面型内质网上的核糖体，也可以染色细胞核（图1-1B）。尼氏染色法主要用于石蜡或冰冻切片染色，染色后使细胞体呈现蓝紫色的斑块状结构，常用于脑或脊髓等部位神经组织基本结构的观察，并以发现尼氏体和尼氏体变性等而闻名，即如果神经元内的尼氏体大而数量多，说明神经元合成蛋白质的功能较强；相反，在神经元受到损伤时，尼氏体的数量会减少甚至消失。尼氏染色法可以染出神经组织中的所有细胞（包括神经元和神经胶质细胞）的细胞体和粗大突起的近侧端，给中枢神经系统的研究开辟了细胞构筑学（cytoarchitectonics）途径。坎贝尔（Campbell）、布罗德曼（Brodmann）、沃格特（Vogt）夫妇等对大脑皮质的分区，以及雷克塞德（Rexed）对脊髓灰质的分层都是以尼氏染色法研究细胞构筑为基础的。

 半个多世纪以来，一直沿用的通过观察染质溶解（chromatolysis）现象判断神经损伤状况是尼氏染色法的一大贡献。这个现象是尼氏于1892年发现的。他切断家兔面神经，几天后发现面神经核神经元的胞体膨大，尼氏体溶解，细胞核也稍膨大且向轴丘对侧的细胞体边缘部移动，神经元中央部呈牛奶样。他把这样的变化叫作原发反应。但染质溶解方法也有其不足之处，如对于侧支较多的神经元，只离断其轴突主干往往胞体变化不明显；在镜下辨认变性神经元需有丰富的经验，特别是小型神经元更难辨认；在神经元已消失的部位虽可根据局部的神经胶质细胞变化加以判断，但不和健侧对比则无法断定消失神经元的数量或形态等。

 四、维格特染色法和马琪染色法

 卡尔 维格特（Karl Weigert，1843—1904），德国病理学家，1884年建立了髓鞘染色的弹力纤维染色法，即维格特染色法（Weigert staining method）（图1-2B）。该法用金属化合物先将神经组织（特别是髓鞘）进行媒染，再以苏木精染色进行显示，是展示神经纤维髓鞘的优良方法。虽然维格特染色法染液的配制过程比较繁杂，但它能够显示出很纤细的弹力纤维，是常规的弹力纤维染色法之一。维格特染色法之后，又出现了不少此法的变法，其中珀尔（Pal）改进的维格特-珀尔染色法（Weigert-Pal staining method）的应用更为普遍。

 维托里奥 马琪（Vittario Marchi，1851一1908），意大利人，1890年发表了用锇酸专门显示神经纤维髓鞘的马琪染色法（Marchi staining method）。锇酸染色法（osmic acid staining method）是神经科学研究的一种常用而普遍的方法，这是由于髓鞘的主要成分是脂质，锇酸可以固定脂质且产生黑色的氧化反应产物，所以该法在过去很长一段时间都用于有髓神经纤维（尤其是变性有髓神经纤维）的染色，曾广泛用于变性有髓纤维束的追踪。由于马琪染色法的这些染色和标记特点，它在神经解剖学早期研究中对束路学研究的贡献颇大。

 五、毕晓夫斯基染色法、格雷斯染色法、瑙塔染色法和芬克-海默染色法

 马琪染色法问世后的几十年中，人们用此法进行了大量的神经束路追踪研究工作，极大地丰富了神经纤维束路（nerve fiber tract）的研究成果。但是马琪染色法只适用于有髓纤维，对无髓纤维及细小的有髓纤维或薄髓纤维则不适用，且易出现假象。由于这种方法不能明确神经元发出轴突终末的终止位置，因而在相当长的时间里，人们希望改善镀银法使之能够追踪无髓纤维或神经纤维的终末。

　银浸染法（silver impregnationmethod）是显不网状纤维*常用的方法，也常用于显示神经末梢。该项技术早在1904年就由毕晓夫斯基（Bielschowsky）用于神经原纤维的研究，后经多次改进，发展成了多种氨银液浸染法（ammonia silver immersion method），也称毕晓夫斯基染色法（Bielschowsky staining method），主要用于显不神经兀、神经原纤维、轴突、神经纤维终末。其*大特点是在显微镜下可控制其反应程度，效果较好。另外，神经末梢是周围神经纤维的终末部分，包括感觉神经末梢和运动神经末梢，分布广泛并且形成多种多样的末梢装置，如触觉小体、环层小体、游离神经末梢、肌梭、运动终板等，毕晓夫斯基染色法也适用于显示这些结构。

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本书通过简明的文字叙述和330幅实验结果的图片介绍神经形态学方法和说明神经系统的结构，为阐明其功能服务。本书内容包括显示神经组织内神经元和神经胶质细胞基本形态特点的传统染色方法，揭示神经纤维联系通(环)路的神经束路追踪方法，定位神经活动相关神经活性物质和受体分布等化学神经解剖学内容的免疫组织化学方法、原位杂交组织化学方法和展现神经组织超微结构的电镜技术方法及其观察结果，形象直观，便于理解、查找和记忆。