基因工程实验项目化教程9787122417626

项目一基因工程实验安全及防护 001

【学习目标】 001

【项目说明】 001

【基础知识】 001

（一）基因工程概述 001

（二）基因工程实验安全及生物安全操作规范 005

【项目实施】 010

任务1-1基因工程实验常用的有毒化学试剂及其防护 010

任务1-2掌握基因工程实验常见仪器设备的操作规程和注意事项 014

任务1-3基因工程实验生物危害废品的处理 019

【能力拓展】 021

（一）火灾及预防 021

（二）触电及急救 026

【实践练习】 032

项目二基因工程实验常用溶液及培养基配制 034

【学习目标】 034

【项目说明】 034

【基础知识】 034

（一）化学试剂的规格和生物试剂的分类 034

（二）溶液浓度的表示、调整和互换 036

（三）溶液的配制 038

（四）生物实验室玻璃器皿的洗涤 042

【项目实施】 044

任务2-1移液器的使用与维护 044

任务2-2配制常用溶液和抗生素 048

任务2-3常用细菌培养基及配制 052

【能力拓展】 055

（一）常用酵母培养基 055

（二）试剂盒 057

（三）体外诊断试剂 059

【实践练习】 062

项目三大肠杆菌基因组DNA的制备 063

【学习目标】 063

【项目说明】 063

【基础知识】 063

（一）核酸的理化性质 063

（二）核酸的分离提取原理 067

（三）核酸的固相提取方法 071

【项目实施】 073

任务3-1制备大肠杆菌基因组DNA的操作准备 073

任务3-2SDS法制备大肠杆菌基因组DNA 076

任务3-3CTAB法制备大肠杆菌基因组DNA 079

任务3-4煮沸法制备大肠杆菌基因组DNA 082

【能力拓展】 083

（一）动物基因组DNA的提取 083

（二）植物基因组DNA的提取 085

（三）酵母基因组DNA的提取 085

（四）总RNA和mRNA的提取 086

【实践练习】 088

项目四PCR扩增大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ基因（ansB） 089

【学习目标】 089

【项目说明】 089

【基础知识】 090

（一）目的基因的分离制备 090

（二）聚合酶链式反应 092

（三）PCR引物设计 095

（四）降落PCR 100

（五）PCR技术的应用 101

【项目实施】 101

任务4-1操作准备 101

任务4-2L-天冬酰胺酶Ⅱ基因（ansB）引物设计 106

任务4-3PCR扩增L-天冬酰胺酶Ⅱ基因（ansB） 110

任务4-4降落PCR优化L-天冬酰胺酶Ⅱ基因（ansB）扩增退火温度 112

【能力拓展】 114

（一）实时荧光定量PCR 114

（二）菌落PCR 122

（三）常用核酸序列数据库 123

【实践练习】 125

项目五质粒pET-28a的制备 126

【学习目标】 126

【项目说明】 126

【基础知识】 126

（一）质粒 127

（二）pET系列质粒 130

（三）质粒DNA的提取方法 132

（四）琼脂糖电泳鉴定质粒DNA 134

（五）质粒DNA浓度和纯度检测 135

【项目实施】 135

任务5-1操作准备 135

任务5-2SDS碱裂解法小量制备质粒pET-28a 137

任务5-3SDS碱裂解法大量制备质粒pET-28a 141

任务5-4少量提取质粒pET-28a的简易方法 142

任务5-5煮沸裂解法快速提取质粒pET-28a 144

【能力拓展】 145

（一）酵母表达载体 145

（二）质粒图谱的绘制 147

（三）质粒资源的获取方式 151

【实践练习】 155

项目六琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA、PCR产物及质粒pET-28a 157

【学习目标】 157

【项目说明】 157

【基础知识】 157

（一）电泳 157

（二）琼脂糖凝胶电泳 158

（三）核酸电泳的指示剂与染色剂 161

（四）核酸电泳的DNA分子量标记 163

【项目实施】 165

任务6-1操作准备 165

任务6-2琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA、质粒pET-28a及PCR产物 166

任务6-3PCR扩增产物的纯化回收 172

【能力拓展】 174

（一）新型核酸荧光染料 174

（二）脉冲场凝胶电泳 177

（三）双相电泳 179

（四）微型凝胶电泳 180

【实践练习】 181

项目七L-天冬酰胺酶Ⅱ基因（ansB）和质粒pET-28a的酶切与连接 182

【学习目标】 182

【项目说明】 182

【基础知识】 182

（一）核酸工具酶及主要功能 182

（二）限制性内切核酸酶 183

（三）DNA连接酶 186

（四）重组DNA分子的构建 188

【项目实施】 188

任务7-1操作准备 188

任务7-2目的基因ansB和质粒pET-28a的双酶切 189

任务7-3目的基因ansB和质粒pET-28a酶切产物的检测、纯化和回收 191

任务7-4目的基因ansB和质粒pET-28a的连接 193

【能力拓展】 195

（一）DNA甲基化酶及其它工具酶 195

（二）Ⅱ型限制性内切核酸酶的几种特殊类型 196

（三）目的基因片段与载体分子的连接方法 197

（四）末端转换常用的方法和使用的主要工具酶 198

【实践练习】 199

项目八将重组质粒pET-28a-ansB转化至大肠杆菌BL21 200

【学习目标】 200

【项目说明】 200

【基础知识】 201

（一）细菌自然转化 201

（二）重组 DNA分子的转化 203

（三）受体细胞与感受态 205

【项目实施】 206

任务8-1操作准备 206

任务8-2大肠杆菌BL21感受态细胞的制备 208

任务8-3用热激法将重组质粒pET-28a-ansB导入大肠杆菌BL21 210

任务8-4用电穿孔法将重组质粒pET-28a-ansB导入大肠杆菌BL21 212

【能力拓展】 214