基于活化蛋白C和凝血酶的内皮细胞作用机制研究9787551734196

第1章绪论

1.1止血机制

1.1.1初级止血

1.1.2二级止血

1.1.3凝血过程的调节

1.1.4纤维蛋白溶解

1.2凝血酶及其多种功能

1.2.1凝血酶的结构

1.2.2凝血过程中的凝血酶功能

1.2.3蛋白酶活化受体

1.2.4凝血酶在细胞信号传导中的作用

1.3蛋白C及其多种功能

1.3.1蛋白C的结构

1.3.2蛋白C的激活

1.3.3APC的抗凝功能

1.3.4 APC的细胞保护途径

1.3.5抗凝血和细胞保护性质的分离

1.4炎症和凝血

1.4.1炎症概述

1.4.2炎症激活凝血反应

1.4.3凝血影响炎症

1.5蛋白激酶C

1.5.1 PKC的结构和活化

1.5.2 PKC的功能

1.6本书的主要工作

第2章研究方法

2.1人类蛋白C变异体的制备

2.1.1构建野生型蛋白C载体

2.1.2点突变的蛋白C突变体

2.1.3XL10-Gold超感受态细胞的转化

2.1.4质粒小规模纯化和突变验证

2.1.5质粒大规模纯化和定量

2.1.6菌群保存

2.2重组人类蛋白C的表达

2.2.1细胞培养

2.2.2 HEK 293细胞的稳定转染

2.2.3细胞系的冷冻保存和复苏

2.2.4蛋白C表达和收集

H0 2.3蛋白C纯化

2.3.1阴离子交换色谱纯化蛋白C

2.3.2纯化蛋白C的分析

2.4蛋白C变异体的主要特性鉴定.

2.4.1蛋白C酶联免疫吸附测定(ELISA)2.4.2使用BCA蛋白质测定评估总蛋白质含量2.4.3蛋白C激活

2.4.4使用S2366测定法定量化活化蛋白C (APC)2.4.5 “APC ELISA”测定蛋白C激活效率

2.5校准的自动血栓造影(CAT)检测

2.5.1 CAT检测原理

2.5.2正常混合贫血小板血浆的制备

2.5.3磷脂囊泡的制备。

2.5.4使用CAT评估APC变体的抗凝活性2.6 PAR1裂解评估

2.6.1 HUVEC提取..

2.6.2 HUVEC培养和传代

2.6.3HUVEC冷冻保存

2.6.4总RNA提取

……

5.2使用IMAC纯化PARlexo肽

5.3PARlexo肽的切割

5.4讨论

第6章APC和凝血酶对内皮细胞(ECs)的信号传导反应

6.1 APC和凝血酶对EC中Erk1/2 MAPK的激活

6.2 APC和凝血酶对EC屏障渗透性的调节

6.3 PARI 和EPCR在APC介导的细胞信号传导中的作用

6.4讨论

第7章PKC在APC和凝血酶介导的内皮细胞反应中的作用

7.1 PKC参与PMA、APC和凝血酶诱导的Erk1/2磷酸化

7.1.1直接PKC激活对Erk1/2磷酸化的影响

7.1.2 PKC同工酶在凝血酶诱导的Erk1/2磷酸化中的作用

7.1.3 PKC在APC诱导的Erk1/2磷酸化中的作用

7.2PKC参与凝血酶或APC诱导的内皮屏障调节

7.2.1 PKC参与凝血酶诱导的内皮屏障功能障碍

7.2.2 PKC参与APC介导的内皮屏障保护作用

7.3凝血酶或APC引起的PKC激活

7.3.1 PKC同源物转位.

7.3.2 PKC磷酸化的评估

7.4凝血酶诱导的EC屏障破坏依赖于Erk1/2的活化

7.5讨论

第8章总结

8.1讨论

8.1.1蛋白C及其变体的表征

8.1.2 APC的细胞保护性信号转导机制及其治疗潜力

8.1.3靶向PKC的治疗前景

8.2总结与展望

参考文献

附录

第1章绪论

1.1止血机制

止血是一种正常的生理反应，既能维持血液的流动性，又能在机体受到损伤时防止大量失血。这个过程受到严格调控，但系统异常可能导致出血或血栓形成。通常认为，凝血包括三个阶段，即初级止血(血小板黏附/聚集)、二级止血(凝血)和纤维蛋白溶解(凝块溶解)。

1.1.1初级止血

初级止血在血管受损时启动，是在损伤部位形成血小板栓塞的过程。血管损伤后，立即的血管反射作用导致血管收缩，这是减少出血的第一步。损伤部位暴露的胶原蛋白会吸引血液循环中的血小板，这通过von Willebrand 因子(VWF)介导。VWF是一种大的多聚糖蛋白，在循环中被血流的剪切力拉伸()。它在血小板表面特定的糖蛋白受体复合物(GPIb/V/IX)和暴露的胶原纤维之间起着桥梁的作用，使血小板黏附在血管内皮下层上(23)。当血小板附着在暴露的胶原蛋白上，即被活化。凝血酶也通过血小板受体如GPIb和蛋白酶激活受体(PARs)诱导血小板活化。活化的血小板会发生去颗粒化，释放出促进血小板聚集的激动剂，如腺苷二磷酸(ADP) 和凝血酶A2。ADP和凝血酶A2进一步促进血小板活化，形成正循环。血小板活化的另一个重要事件是激活血小板表面的某些整合素。整合素是异二聚体的细胞表面受体，介导细胞-细胞或细胞-基质相互作用6。血小板整合素能够结合胶原蛋白和纤维蛋白原/纤维蛋白，通过与纤维蛋白原的结合诱导血小板聚集，从而形成不稳定的原始血小板栓塞5。血小板的激活还会导致其膜上出现磷脂酰丝氨酸，为凝血级联反应的各组分提供带有负电荷的磷脂酰基表面“

1.1.2二级止血

二级止血，也称凝血级联反应(图1.1)，涉及一系列凝血因子和辅因子的蛋白酶活化，它们高度协调地工作，生成凝血酶，最终导致纤维蛋白的形成。纤维蛋白强化了原始的血小板栓塞，并形成更稳定的纤维蛋白凝块。

凝血级联反应包括一系列有序的酶促反应，最初被认为依赖于两个凝血途径(即内源性途径和外源性途径)的激活8。在当前广为接受的体内凝血模型中，组织因子(TF) 代表了凝血的主要启动因子。TF是一种跨膜蛋白质，通常不与血液直接接触(。在正常生理条件下，凝血因子以其非活性前体形式存在于血液循环中，其中约有1%的因子VII(FVII)以被激活形式存在[10]。当血管受损时，活化的因子VII(FVIa)接触到已暴露的TF，从而启动“外源性途径”[9)。TF/F VIIa复合物催化FIX和FX的激活，其中后者可以通过激活凝血酶原生成微量的凝血酶川。这个阶段生成的少量凝血酶促进了凝血因子FV和FV的反馈激活，以及蛋白酶前体FXI的激活。凝血过程的扩增涉及由FIXa及其辅因子FVa在负电荷磷脂表面(由活化血小板提供)上形成的“凝血酶生成酶复合物”[。该复合物促进FXa更有效被激活(50~100倍于TF/F VIla的激活)，从而避免了对TF/F VIa作为FXa主要来源的依赖[，12)。此外，凝血酶产生的FVa也作为FXa的辅因子形成凝血酶生成酶，其催化凝血酶原激活的效率相比FXa单独催化高出1x10’倍13。进而，在血管损伤部位快速生成凝血酶。

止血与凝血是生物体应对血液流失的自我保护机制，它的有序进行对有机体的生存有着巨大的意义。凝血的绝大部分过程是由存在于血清中的各种凝血和抗凝血因子的协同作用下进行的，因此对这些因子结构和功能上的研究有助于我们了解血液生理和病理机制，对于开发针对各种血液疾病的治疗方案和药物有着重要的临床转化价值。活化蛋白C(APC)是血液抗凝剂中重要的一员。近年来，有报道发现APC担负着对血管内皮细胞的保护作用，并且这个作用对败血病患者有着潜在的治疗效果。然而，人们对APC如何发挥该功能的作用机制尚未明确。有趣的是，凝血酶作为血液中重要的凝血因子，与APC共用同一种细胞外膜受体，但却表现出完全相反的作用。本书通过对APC和凝血酶在内皮细胞上的信号通路进行研究，逐步揭示APC细胞保护作用的作用机制的研究方法和成果。