宏基因组学：方法与步骤（原书第二版）

图书标准信息

• 作者 [德]W.R.施特赖持 主编；青岛华大基因研究院 译
• 出版社 科学出版社
• 出版时间 2023-06
• 版次 31
• ISBN 9787030757951
• 定价 198.00元
• 装帧 其他
• 开本 16开
• 页数 292页
• 字数 367千字

【内容简介】

本书共19章。详细介绍了以下内容：不同类型环境，包括海水环境、低温及碱性极端环境、植物内生环境等样本的DNA/RNA提取及宏基因组文库构建技术；从核酸、脱氧核酸、蛋白质三个角度分析环境微生物代谢活性；通过宏基因组测序获得功能基因分类及多样性的方法；从基因组学技术层面介绍复杂微生物群落的研究方法，以及挖掘活性基因（如有机物降解基因）及其表达的技术与工具；高通量地筛选活性酶基因如水解酶、纤维素酶、新型PHA代谢酶、磷酸酶、氢化酶、N-AHSL干扰酶等的方法；如何挖掘增加微生物次级代谢的信号。

【目录】

前言 

贡献者 

章 构建小插入片段和大插入片段的宏基因组文库 1 

1.1 介绍 1 

1.2 实验材料 2 

1.2.1 宏基因组dna 2 

1.2.2 小片段文库构建 2 

1.2.3 大片段文库构建 3 

1.3 实验方法 4 

1.3.1 小片段宏基因组文库构建 4 

1.3.2 大片段宏基因组文库构建 8 

1.4 注释 10 

参文献 11 

第2章 从海洋过滤样本提取dna与rna及用于标记基因研究的cdna通用模板的制备 13 

2.1 介绍 13 

2.2 实验材料 14 

2.2.1 浮游细菌样品 14 

2.2.2 dna 与rna同时提取 14 

2.2.3 提取的dna与rna纯化 15 

2.2.4 dna消化和pcr对照 15 

2.2.5 链和第二链合成 16 

2.3 实验方法 16 

2.3.1 从海水滤膜样品中同时提取dna与rna 16 

2.3.2 纯化dna与rna 18 

2.3.3 链和第二链合成 20 

2.4 注释 20 

参文献 21 

第3章 海洋宏基因组大片段文库的构建与筛选 22 

3.1 介绍 22 

3.2 实验材料 23 

3.2.1 取样 23 

3.2.2 宏基因组dna的分离 24 

3.2.3 16s rdna系统发生分析 24 

3.2.4 构建宏基因组大片段文库 25 

3.2.5 从宏基因组文库筛选具有群体感应抑制活的基因 25 

3.3 实验方法 25 

3.3.1 取样流程 25 

3.3.2 宏基因组dna分离 27 

3.3.3 16s 扩增子测序 28 

3.3.4 大片段文库构建 29 

3.3.5 采用pcr扩增对宏基因组文库进行基于序列的筛选 31 

3.3.6 基于功能的宏基因组文库筛选32 

3.4 注释 35 

参文献 36 

第4章 寒冷和碱特别环境宏基因组文库的构建与筛选 40 

4.1 介绍 40 

4.2 实验材料 42 

4.2.1 完整的细胞提取和dna提取 42 

4.2.2 文库构建 42 

4.2.3 酶活筛选 43 

4.3 实验方法 43 

4.3.1 从伊卡岩柱样品中获取dna 43 

4.3.2 文库构建 45 

4.3.3 低温和高ph条件下酶活的筛选 47 

4.3.4 宏基因组的偏差评估及酶潜力的检测 49 

4.4 注释 49 

参文献 50 

第5章 基于dna/rna/蛋白质的稳定同位素探针技术用于活微生物标志物的 高通量分析 52 

5.1 介绍 53 

5.2 实验材料 55 

5.2.1 稳定同位素探针技术所需的试剂和设备 55 

5.2.2 核酸纯化 56 

5.2.3 dna/rna超速离心 56 

5.2.4 16s rrna基因测序 57 

5.2.5 宏基因组/宏转录物组测序 57 

5.2.6 蛋白质纯化的试剂和设备 57 

5.2.7 蛋白质胶内消化 57 

5.3 实验方法 58 

5.3.1 被标记的土壤和沉积物样本的酸提取 58 

5.3.2 通过氯化铯梯度离心分离同位素标记的dna 59 

5.3.3 通过cstfa分离同位素标记的rna 61 

5.3.4 宏基因组和宏转录物组分析 62 

5.3.5 提取已标记样本中的蛋白质 62 

5.3.6 凝胶胰蛋白酶消化 63 

5.3.7 利用高分辨率质谱分析同位素标记的蛋白质 64 

5.4 注释 65 

参文献 66 

第6章 植物内生细菌和真菌的多样评估 68 

6.1 介绍 68 

6.2 实验材料 69 

6.2.1 植物样本采集 69 

6.2.2 处理植物材料 69 

6.2.3 从粉末化的植物样本中提取dna 70 

6.2.4 标记基因扩增 70 

6.2.5 测序数据的处理 71 

6.3 实验方法 71 

6.3.1 植物样本采集 71 

6.3.2 处理植物材料 71 

6.3.3 dna 提取 72 

6.3.4 标记基因的扩增和测序 72 

6.3.5 测序数据的处理 74 

6.4 注释 76 

参文献 77 

第7章 通过宏基因组鸟法测序技术研究复杂微生物群落中的植物软腐病肠杆菌科病原菌 78 

7.1 介绍 78 

7.1.1 软腐病肠杆菌科 78 

7.1.2 分泌系统 79 

7.1.3 基因水转移 79 

7.1.4 宏基因组 80 

7.2 实验材料 80 

7.2.1 dna提取 80 

7.2.2 dna富集 80 

7.2.3 dna文库制备 80 

7.2.4 实验室设备 80 

7.2.5 软件 81 

7.3 实验方法 81 

7.3.1 鸟法宏基因组测序 81 

7.3.2 实验设计和采样 82 

7.3.3 组装前的数据预处理 84 

7.3.4 物种多样分析 84 

7.3.5 物种和功能注释 85 

7.3.6 特定的注释工具 87 

7.4 注释 88 

7.5 结 88 

参文献 89 

第8章 来源于宏基因组的基因在变铅青链霉菌中的克隆、表达和发酵优化 92 

8.1 介绍 92 

8.2 变铅青链霉菌的转化 94 

8.2.1 实验材料 94 

8.2.2 实验方法 97 

8.3 链霉菌载体及其特征 101 

8.3.1 实验材料 107 

8.3.2 实验方法 109 

8.4 链霉菌中的基因表达调控元件 112 

8.4.1 实验材料 114 

8.4.2 实验方法 115 

8.5 采用基于pamr4系统的同源重组技术将由选用的启动子控制的目的基因整合到变铅青链霉菌染体上 118 

8.5.1 实验材料 119 

8.5.2 实验方法 119 

8.6 重组变铅青链霉菌的发酵 120 

8.6.1 实验材料 120 

8.6.2 实验方法 121 

8.7 注释 124 

参文献 127 

第9章 基于宏基因组数据的降解网络重建 132 

9.1 介绍 132 

9.2 实验材料 133 

9.3 实验方法 133 

9.3.1 宏基因组序列中分解代谢基因的鉴定 133 

9.3.2 创建降解节点列表 134 

9.3.3 设定网络的节点 136 

9.3.4 添加节点和网络之间的连接 136 

9.3.5 设置网络中节点的坐标 139 

9.3.6 绘制降解网络 140 

9.4 注释 142 

参文献 142 

0章 宏基因组dna功能表达的新工具 144 

10.1 介绍 144 

10.2 实验材料 146 

10.2.1 细菌菌株、培养基和抗生素 146 

10.2.2 载体 148 

10.2.3 感受态细胞的制备：溶液和试管 150 

10.2.4 用于dna提取和纯化的溶液 152 

10.2.5 商业化试剂盒 153 

10.2.6 酶 153 

10.2.7 dna梯状条带 154 

10.2.8 设备和材料 154 

10.3 实验方法 155 

10.3.1 用穿梭载体pebp18构建宏基因组文库 155 

10.3.2 用trex表达基因簇 161 

10.3.3 颖壳伯克霍尔德菌的表达 165 

10.3.4 荚膜红细菌的表达 168 

10.4 注释 171 

参文献 174 

1章 基于微孔板的活和立体选择水解酶的筛选 178 

11.1 介绍 178 

11.2 实验材料 179 

11.2.1 琼脂板活实验（涂板） 179 

11.2.2 微孔板培养 179 

11.2.3 细胞裂解 180 

11.2.4 酶活测定 180 

11.3 实验方法 181 

11.3.1 琼脂板活测试 181 

11.3.2 微孔板中酶的合成 181 

11.3.3 微孔板中的细胞裂解 182 

11.3.4 活或手选择的筛选 182 

11.4 注释 183 

参文献 184 

2章 基于宏基因组文库的纤维素酶的筛选 185 

12.1 介绍 185 

12.2 实验材料 187 

12.2.1 无机盐培养基（msm） 187 

12.2.2 刚果红板检测 188 

12.2.3 细胞粗萃取物的制备 188 

12.2.4 dnsa检测 188 

12.2.5 纤维素酶反应产物的薄层谱分析 188 

12.2.6 通过 hplc 分析纤维素分解产物 189 

12.3 实验方法 189 

12.3.1 高纤维素分解微生物群落的富集 189 

12.3.2 在刚果红板上筛选纤维素酶阳克隆 189 

12.3.3 可能阳克隆的再转化 190 

12.3.4 具有纤维素分解活克隆的细胞粗萃取物的制备 190 

12.3.5 纤维素酶活的分析 190 

12.4 注释 194 

参文献 194 

3章 利用对硝基苯基底物筛选宏基因组文库中辅助木质纤维素酶的 液相复用高通量筛选技术 197 

13.1 介绍 197 

13.2 实验材料 199 

13.2.1 克隆文库培养与表达 199 

13.2.2 对硝基苯基底物液相检测 199 

13.3 实验方法 200 

13.3.1 克隆文库的叠加复用 200 

13.3.2 液相pnp检测 201 

13.3.3 鉴定含有目标酶的克隆 202 

13.4 注释 202 

参文献 204 

4章 修饰多酚类底物的糖基转移酶的筛选 206 

14.1 介绍 206 

14.2 实验材料 207 

14.2.1 生物转化形成反应 207 

14.2.2 利用薄层谱对转化产物进行分析 208 

14.3 实验方法 208 

14.3.1 宏基因组克隆文库的生物转化反应 208 

14.3.2 准备宏基因组样品以供tlc分析 209 

14.3.3 生物转化产物的tlc分析 209 

14.3.4 酶检测 210 

14.4 注释 211 

参文献 212 

5章 从复杂微生物群落中分离编码新型pha代谢酶基因的方法 213 

15.1 介绍 213 

15.2 实验材料 215 

15.2.1 细菌生长培养基 215 

15.2.2 分子生物学试剂 216 

15.3 实验方法 216 

15.3.1 细菌生长和储存条件 216 

15.3.2 土壤宏基因组文库的构建 217 

15.3.3 利用三亲本接合法将宏基因组文库转移到苜蓿中华根瘤菌和恶臭单胞菌中 217 

15.3.4 转移来自苜蓿中华根瘤菌或恶臭单胞菌定的互补克隆至大肠杆菌中 217 

15.3.5 遗传分子生物学 218 

15.3.6 pha积累 218 

15.3.7 pha合成克隆宏基因组文库的筛选 219 

15.3.8 利用营养缺陷从宏基因组文库中分离phb循环基因 220 

15.4 注释 221 

参文献 222 

6章 基于功能宏基因组文库的酸酶活编码基因的筛选和异源表达 224 

16.1 介绍 224 

16.2 实验材料 225 

16.2.1 基于功能宏基因组文库筛选鉴定酸酶基因 225 

16.2.2 酸酶基因的异源表达 226 

16.3 实验方法 227 

16.3.1 通过基于功能宏基因组文库的筛选鉴定酸酶基因 227 

16.3.2 酸酶基因的有效异源表达 229 

16.4 注释 232 

文献 233 

7章 基于活宏基因组文库的氢化酶筛选 235 

17.1 介绍 235 

17.2 实验材料 236 

17.2.1 实验室仪器 236 

17.2.2 菌株、质粒和生长培养基 236 

17.2.3 试剂盒和（内切）酶 237 

17.3 实验方法 237 

17.3.1 宏基因组文库构建及其与广泛宿主载体prs44连接 238 

17.3.2 宏基因组文库中吸氢活基因的筛选 239 

17.4 注释 242 

参文献 242 

8章 基于n-ahsl信号的干扰酶筛选 244 

18.1 介绍 244 

18.2 实验材料 246 

18.2.1 细胞培养的菌株和生长介质 246 

18.2.2 n-ahsl降解实验 246 

18.2.3 薄层谱法 247 

18.2.4 hplc 247 

18.3 实验方法 248 

18.3.1 用于n-ahsl降解实验的rc和cce的制备 248 

18.3.2 微孔板快速筛选n-ahsl降解单克隆或混合克隆池 249 

18.3.3 n-ahsl内酯酶和酰基转移酶活筛选/n-ahsl降解验证实验 251 

18.3.4 hplc-ms鉴定n-ahsl内酯酶的活 254 

18.3.5 hplc检测n-ahsl酰基转移酶的活 254 

18.4 注释 255 

参文献 257 

9章 挖掘微生物信号分子助力次级代谢产物的生物探索 259 

19.1 介绍 259 

19.2 实验材料 260 

19.2.1 培养基配方 261 

19.2.2 群体感应生物传感器菌株 261 

19.2.3 高通量自动化筛选台 261 

19.2.4 qs信号分子的验证 262 

19.2.5 hplc-ms分析ahl和ahq化合物的特征 262 

19.2.6 在致病菌系统中验s活 263 

19.3 实验方法 263 

19.3.1 从宏基因组文库中筛选 qs 活克隆 263 

19.3.2 qs 活物质的提取和验证 265 

19.3.3 hplc鉴定qs活化合物 267 

19.3.4 在模式致病菌系统中实验验证ahl化合物 268 

19.4 注释 269 

参文献 270