【现货速发】苹果抗炭疽菌叶枯病基因的分子标记及遗传定位
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作者刘源霞
出版社中国农业科学技术出版社
ISBN9787511642158
出版时间2019-06
装帧平装
开本16开
定价68元
货号27912255
上书时间2024-12-19
商品详情
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前言
前言
苹果炭疽菌叶枯病(Glomerella Leaf Spot，GLS)是中国苹果产区新出现的一种为害严重的流行性病害，主要为害苹果叶片，造成病叶早期干枯、脱落，也侵染果实引起坏死性斑点。该病不仅导致当季果实产量和品质的下降，而且大大削弱了翌年的树势，严重的威胁着苹果产业的发展。目前，对苹果炭疽菌叶枯病的防治仍以化学防治为主，但成效甚微。培育和种植抗病性强的优良品种是控制该病为经济、安全、有效的措施。
随着分子生物学的快速发展，分子标记辅助选择技术逐渐成为植物抗病育种的有效手段。本书作者首先利用人工离体接种鉴定的方法，评价了苹果对炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，之后筛选出与苹果炭疽菌叶枯病抗性基因位点（Rgls）紧密连锁的SSR分子标记，然后通过全基因组重测序技术开发了与苹果抗炭疽菌叶枯病相关的SNP及Indel标记，结合SSR标记定位的结果，进行了SNP及Indel标记的验证，完成了对Rgls基因位点的精细定位，后利用筛选出的四个与Rgls基因位点紧密连锁的分子标记在苹果栽培品种及品系中验证了标记的可靠性。
一是抗性遗传规律评价。利用2个对苹果炭疽菌叶枯病高抗品种（系）‘富士’‘QF-2’和两个高感品种‘金冠’‘嘎拉’为亲本配制了4个杂交群体(‘富士’ב金冠’‘金冠’ב富士’‘嘎拉’× ‘富士’‘富士’בQF-2’)。以杂交群体F1植株为试验材料，对苹果炭疽菌叶枯病的抗性进行了鉴定评价和遗传分析。结果表明，4个杂交群体中抗、感植株的分离比分别符合11、11、01和10的理论比值，初步推测苹果抗炭疽菌叶枯病性状受隐性单基因控制，抗病基因型为rr，感病基因型为RR和Rr。
二是SSR标记的开发及抗性基因位点Rgls的遗传定位。利用207株‘金冠’ב富士’的杂交后代为试材，采用分离群体分组分析（BSA）方法，构建SSR标记与抗性基因位点Rgls连锁图谱。通过对300对均匀覆盖苹果染色体组的已发表的SSR引物在亲本及抗感池中进行初步筛选，将产生多态性条带的引物进行群体验证，获得了两个与抗病性状相关的分子标记CH01d08和CH05g05，这两个标记位于抗性基因位点Rgls两侧，将其定位于15条染色体上。重组率分别为73%和 232%。依据苹果基因组CH01d08和CH05g05标记之间的序列，自行设计了276对SSR引物。终筛选出9对与Rgls基因位点连锁的分子标记。这11个标记的遗传距离从05 cM 到338 cM，覆盖了492 cM的遗传距离，近的标记为S0405127遗传距离为05 cM。Rgls基因位点两侧近的两个标记S0304673和S0405127之间的物理距离为500kb。
三是SNP标记和Indel标记的开发、验证Rgls基因位点的精细定位。基于全基因组重测序技术共开发SNP位点3 399 950个，InDel位点573 040个。通过对△(SNP-index)的筛选，在全基因组范围内共得到33个候选的SNP位点及所对应的29个候选基因。通过与SSR标记定位结果相结合终锁定18个SNP位点、30个InDel位点，以及5个候选基因。通过高分辨熔解曲线（HRM）分析技术对SNP及InDel标记进行验证。获得了6个SNP 及5个InDel标记与Rgls基因位点紧密连锁。通过对这11个标记重组个体的分析，将Rgls基因所在位点的范围缩小为58kb。
四是5个抗病候选基因的鉴定。通过对5个候选基因MDP0000686092、MDP0000205432、MDP0000120033、MDP0000864010、MDP0000945764的生物信息学分析，并利用实时荧光定量PCR对经过炭疽叶枯病病原菌侵染后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h的7个时间段内，叶片中5个候选基因表达量变化进行分析。结果表明，5个候选基因均不同程度的响应炭疽叶枯病病菌的诱导，是苹果炭疽叶枯病的抗病相关基因。
五是分子标记可靠性验证。利用4个紧密连锁的分子标记S0405127、S0304673、SNP4236和InDel4254对50个田间栽培品种和青岛农业大学选育出的优系进行了抗炭疽菌叶枯病的基因型鉴定，并结合其抗病的表型鉴定对4个标记的准确性进行了分析。结果表明4个标记的准确率分别为900%、940%、980%和960%，可以有效的应用于分子标记辅助育种。通过苗期对炭疽菌叶枯病抗性的选择，可以显著的减少成本，缩短抗病育种周期，加快抗病育种进程。
著者2019年4月
导语摘要
苹果炭疽菌叶枯病是我国苹果产区新出现的一种危害严重的流行性病害。 本书评价了苹果对炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，筛选出与苹果炭疽菌叶枯病抗性基因位点（Rgls）紧密连锁的分子标记，完成了对Rgls基因位点的精细定位。
作者简介
刘源霞，女，中共党员，汉族，1974年1月出生于山东省荣成市。1993.9—1997.7 山东农业大学攻读学士学位；1997.7—2002.9 山东省荣成市宁津镇政府工作；2002.9—2006.9 山东省荣成市农业局工作；2006.9—2009.9 青岛农业大学攻读硕士学位；2009.7—至今 青岛农业大学工作；2013.9—2016.12 湖南农业大学园艺园林学院攻读博士学位
目录
章文献综述（）
节苹果炭疽菌叶枯病的发生与为害（）
一、苹果炭疽菌叶枯病的为害症状（）
二、苹果炭疽菌叶枯病的病原（）
三、苹果炭疽菌叶枯病的侵染规律（）
第二节植物与病原微生物互作的机制（）
一、植物对病原微生物侵染的基础抗性(PTI)（）
二、病原微生物对PTI的抑制（）
三、植物对病原微生物的基因对基因抗性(ETI)（）
四、抗病分子机理研究对作物抗病育种的影响（）
第三节抗病基因的分子鉴定方法（）
一、近等基因系法（）
二、分离群体分组分析法（）
第四节分子标记技术研究进展（）
一、分子标记概述（）
二、分子标记的种类（）
三、分子标记在苹果上的应用（）
第五节研究目的与意义（）
第二章苹果对炭疽菌叶枯病抗性遗传的研究（）
节材料与方法（）
一、植物材料（）
二、供试病菌（）
三、试验方法（）
第二节结果与分析（）
一、不同苹果品种（系）对炭疽菌叶枯病的抗性表现（）
二、苹果F1植株对炭疽菌叶枯病抗性表现及抗性遗传规律分析（）
三、苹果杂交亲本及后代对炭疽菌叶枯病抗性的基因型推测（）
第三节讨论与小结（）
第三章苹果抗炭疽菌叶枯病基因的SSR标记筛选及遗传定位（）
节材料与方法（）
一、植物材料（）
二、DNA的提取及检测（）
三、抗感 DNA 池的构建（）
四、SSR分子标记的筛选与开发（）
第二节结果与分析（）
一、基因组DNA的检测（）
二、抗性基因的分子标记筛选（）
三、遗传距离计算和抗性基因位点连锁图谱构建（）
四、SSR标记的测序分析（）
第三节讨论与小结（）
第四章基于WGR技术开发与苹果抗炭疽菌叶枯病基因相关联的SNP、Indel标记及抗病候选基因的鉴定（）
节材料和方法（）
一、植物材料（）
二、DNA、RNA的提取，cDNA的合成及抗感池的构建（）
三、文库构建及库检（）
四、上机测序（）
五、生物信息分析流程（）
六、原始数据的获得与处理（）
七、与参考序列的比对（）
八、SNP和InDel的检测及注释（）
九、SNP数据统计（）
十、子代SNP频率差异分析（）
十一、目标性状区域定位（）
十二、基因表达定量分析（）
第二节结果与分析（）
一、测序数据质量（）
二、Reads与参考基因组比对情况统计（）
三、SNP频率和转换/颠换率计算（）
四、SNP及InDel检测及注释（）
五、子代SNP频率差异分布（）
六、目标性状区域定位（）
七、候选基因的功能预测（）
第三节讨论与小结（）
第五章基因Rgls位点的精细定位及分子标记可靠性验证（）
节材料与方法（）
一、植物材料（）
二、抗感 DNA 池的构建（）
三、SNP引物的设计（）
四、高分辨率熔解曲线分析（）
五、SNP、InDel 标记的筛选验证（）
六、基因Rgls位点的精细定位（）
七、基因Rgls位点区域内的基因分析（）
八、分子标记准确性鉴定（）
第二节结果与分析（）
一、SNP及InDel标记的筛选（）
二、SNP 及InDel 标记的验证（）
三、基因Rgls位点的精细定位（）
四、基因Rgls位点区域内的基因分析（）
五、标记在品种（系）中的鉴定（）
第三节讨论与小结（）
第六章主要结论与创新点（）
节主要结论（）
一、苹果抗炭疽菌叶枯病性状受隐性单基因控制（）
二、苹果抗炭疽菌叶枯病基因位点被定位于苹果第15条染色体上，与11个SSR标记连锁（）
三、利用全基因组重测序技术将Rgls基因位点快速定位在第15条染色体上，并筛选出5个响应炭疽菌叶枯病病原菌诱导的候选基因（）
四、利用SNP 及InDel 标记将Rgls基因位点精细定位在58 kb的区域内（）
五、4个与抗性基因位点紧密连锁的分子标记可用于MAS（）
第二节创新点（）
参考文献（）
附录（）
附录一DNA的提取方法（）
附录二琼脂糖凝胶电泳的检测方法（）
附录三非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备及银染方法（）
附录四SSR标记序列分析方法（）
附录五5个候选基因编码的氨基酸序列（）
内容摘要
苹果炭疽菌叶枯病是我国苹果产区新出现的一种危害严重的流行性病害。 本书评价了苹果对炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，筛选出与苹果炭疽菌叶枯病抗性基因位点（Rgls）紧密连锁的分子标记，完成了对Rgls基因位点的精细定位。
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刘源霞，女，中共党员，汉族，1974年1月出生于山东省荣成市。1993.9—1997.7 山东农业大学攻读学士学位；1997.7—2002.9 山东省荣成市宁津镇政府工作；2002.9—2006.9 山东省荣成市农业局工作；2006.9—2009.9 青岛农业大学攻读硕士学位；2009.7—至今 青岛农业大学工作；2013.9—2016.12 湖南农业大学园艺园林学院攻读博士学位
精彩内容
章文献综述
苹果(Malus x domestica Borkh)是世界上栽培为普遍的落叶果树之一，有着很强的生态适应性，地域分布极为广泛。中国不仅是苹果属植物的发源地之一，拥有悠久栽培历史和极为丰富的苹果种质资源，也是世界上的苹果生产国和消费国，在世界苹果产业中占有重要的地位。近年来，我国苹果栽培面积快速增长，苹果产量和质量得到了稳步提髙。据统计数据显示，2015年我国苹果栽培面积和产量分别达到232万hm2 和4 300万t，居世界首位。苹果在调整农业产业结构、增加农民收入、促进地方经济快速发展等方面发挥着越来越重要的作用。
病害是制约着苹果产业发展的重要影响因素。其中苹果炭疽病是苹果生产中普遍发生的一种重要病害，包括发生在果实上的苦腐病（Bitter rot of apple）和主要发生在叶片上的炭疽菌叶枯病（Glomerella leaf spot，GLS）。苦腐病又被称作晚腐病，是苹果果实的三大病害之一，多在果实成熟期或半成熟期发病，主要是引起大量落果、果实腐烂，降低了果实的产量和商品价值。而苹果炭疽菌叶枯病是一种流行性很强的病害，由于该病潜育期短、发病快，在外界环境条件适宜的情况下从侵染到发病落叶仅需要3 d或者更短的时间，造成树叶大量干枯、脱落，严重时形成二次开花，也侵染果实引起坏死性斑点，不仅导致当季果实产量和品质的下降，而且大大削弱了翌年的树势，严重地威胁着苹果产业的发展。特别是广泛种植于我国各大苹果产区的重要栽培品种‘金冠’‘嘎拉’品种极易感病，尤其是‘金冠’ 在世界苹果生产国中（中国除外）品种比例，这也是选择‘金冠’作为苹果基因组测序材料的重要原因。它不仅是生产上的优良品种，同时也是苹果育种的核心亲本（陈学森，2015），所以炭疽菌叶枯病的侵染不仅仅是对‘金冠’‘嘎拉’等品种的侵害，而可能是对‘金冠’系、‘嘎拉’系苹果的为害。
化学药物防治是目前采用的主要防治方法，但成效甚微。所以急需培育出抗病品种从根本上解决该问题，同时也减少了果园化学试剂的使用，降低农药残留，保证果品的安全。但育种实践表明，要实现育种目标，在亲本选择与选配恰当的前提条件下，必须保证每个杂交组合有足够数量的后代群体，至少3 000株(陈学森，2010)，加上果树具有童期长（6～12年），基因组高度杂合，杂种后代广泛分离，自交不亲和，许多重要的经济性状是多基因控制的数量性状等特点，使得常规育种工作难度大、周期长。因此利用杂交后代早期选择技术，及早地剔除非目标基因的单株，减少杂种后代的数目，提高筛选效率，减少盲目性是提高育种效率的实用有效的方法。
随着分子生物学技术的快速发展，特别是以DNA多态性为基础的分子标记技术在苹果育种中的应用，大大提高了目标性状早期选择的效率，缩短了育种周期，加快了新品种选育的速率。同时，通过构建高密度分子标记遗传图谱对重要农艺性状基因进行标记定位，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并验证其功能，阐明其作用机制，通过基因工程实现对果树性状的改良。
因此，揭示苹果炭疽菌叶枯病的抗性遗传规律，发掘与抗性基因紧密连锁的分子标记，构建精细的抗病遗传图谱对于定位抗病基因，研究基因功能，探索、掌握抗病机制，培育抗病品种有着重要的意义。
节苹果炭疽菌叶枯病的发生与为害
苹果炭疽菌叶枯病(Glomerella Leaf Spot，GLS)是近几年在中国大部分苹果主产区新出现的一种流行性很强的真菌病害。主要为害苹果叶片，造成病叶早期的干枯、脱落，也侵染果实引起坏死性斑点，导致苹果失去商品价值（刘源霞等，2015）。该病于1988年首次报道于巴西，导致感病的‘嘎拉’苹果70%以上的叶片脱落，经鉴定其病原为围小丛壳Glomerella cingulate（Leite et al,1988；Camilo & Denardi，2002；González et al，1999，2003），为盘长孢状刺盘孢 Colletotrichum gloeosporioides 的有性态，定名为围小丛壳叶斑病（Glomerella leaf spot，GLS），在中国被称为炭疽菌叶枯病。
1997—1999年在巴西6个苹果产区均发现了炭疽菌叶枯病，由于‘嘎拉’品种是巴西的主栽品种，所以该病严重威胁着巴西苹果产业，成为巴西苹果的主要病害(Katsurayama et al，2000；Crusius et al，2002；Velho et al，2014)。1998年在美国田纳西州的两个‘嘎拉’果园中暴发了苹果炭疽菌叶枯病，引起大量落叶，这也是美国首次报道苹果炭疽菌叶枯病的发生，随后在佐治亚州和北卡罗来纳州也发现了这种病害(González，1999，2003)。我国早于2008年发现了炭疽菌叶枯病（王素芳，2009），2010年相继报道了在黄河故道苹果主产区发现了炭疽叶枯病，该病引起‘嘎拉’‘金冠’等苹果的大量落叶。尤为严重的是在2011年，据报道江苏丰县、安徽砀山、淮北等地栽培的‘嘎拉’‘金冠’等苹果品种大面积发生叶斑病，导致叶片干枯脱落，严重的造成果树二次开花(宋清等，2012)(附图1-1)。经鉴定该病为苹果炭疽菌叶枯病，病原为围小丛壳Gcingulata(宋清等，2012;Wang et al，2012)。González等（2006）通过利用 mtDNA-RFLP对病原菌的甘油酸脱氢酶核苷酸序列进行分析，认为引起GLS的病原分别属于尖孢炭疽菌Cacutatum 和围小丛壳Gcingulata。这两种菌分别归属于尖胞刺盘孢复合群和盘长孢状刺盘孢复合群（王嶶等，2015）。王薇等（2015）的研究明确了在我国引起该病害的病原为果生刺盘孢（Colletotrichum fructicola）和隐秘刺盘孢（Caenigma），均归属于盘长孢状刺盘孢复合群。中国是否存在尖孢刺盘孢复合群的病原，还没有明确的结论。
一、苹果炭疽菌叶枯病的为害症状
由苹果叶枯炭疽菌引起的苹果炭疽菌叶枯病症状为（附图1-2）：在幼叶上发病时，初期表现为红至黄褐色或红褐色小点，针尖大小，边缘不规则，病健交界不清晰。在老叶上发病时，初期表现为黑色坏死性病斑，病斑边缘模糊。在7—8月高温高湿或连续阴雨的条件下，病斑迅速扩展，2～3 d便可使整个叶片失水、焦枯、变黑、坏死，很快脱落。感病叶片在环境条件不适宜时，病斑停止扩展，在叶片上形成大小不等的枯死斑，病斑周围的健康组织逐渐变黄，叶片呈现花叶状，病重叶片逐渐脱落。病斑的形状多为圆形或椭圆形，也可能形成不规则的形状。病原菌侵染果实时，前期为红褐色小点，然后变为圆形或近圆形红褐色斑点，病斑周围有红褐色晕圈，中间变为灰白色，微凹。在自然环境条件下果实病斑上很少产生分生孢子，与常见的苹果炭疽病的症状明显不同。叶片上的病斑多为直径在 1～2 mm的小斑点，也有少数病斑直径超过1 cm。后期病斑中央产生黑色小点(分生孢子盘)，呈轮纹状排列，病斑上形成大量淡黄色分生孢子堆，当孢子萌发时会在病斑上产生白色丝状物（宋清等，2012；符丹丹，2014）。
二、苹果炭疽菌叶枯病的病原
苹果炭疽菌叶枯病的病原菌有性世代为Glomerella cingulata(Stonem）Spauld & Schrenk，属真菌子囊菌(亚)门，球壳目，小丛壳属，围小丛壳菌；无性世代为胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides(Penz）Penz& Sacc和尖孢炭疽菌Cacutatum JHSimmonds（González，2003）。在PDA 平板上培养的菌落特征为（附图1-2e）：菌落边缘完整，呈规则圆形，气生菌丝呈絮状，比较稀疏，边缘颜色为白色中间为淡灰色。分生孢子堆呈柠檬色或橙色(符丹丹，2014)。
三、苹果炭疽菌叶枯病的侵染规律
在一般情况下，苹果炭疽叶枯病病原菌主要在苹果的休眠芽和枝条上越冬，也可以以菌丝体的形态在病僵果、干枝、果台和有虫害的树枝上越冬。5月在条件适宜的情况下产生分生孢子，成为初侵染源，越冬的子囊壳也是初侵染源之一（宋清等，2012）。病原孢子可以随着雨水或气流传播，经皮孔或伤口侵染后，进入苹果叶片或果实内。病害发生时，首先形成中心病株，随后迅速的向四周蔓延侵染，可多次侵染，终造成病害大面积的发生。
Wang等(2015)的试验结果表明，温度和湿度是炭疽菌叶枯病发生的必要条件。苹果炭疽菌叶枯病病原菌分生孢子萌发的温度范围在15～35℃，适宜温度为30℃。菌丝生长的温度范围在15～35℃，适宜温度为25℃。炭疽菌叶枯病病原菌主要依靠雨水传播，病原菌分生孢子的萌发和侵染也需要自由水或高湿环境，而我国北方苹果主产区6—8月气温多在30℃左右，雨水充沛，满足了苹果炭疽菌叶枯病病原菌的传播、侵染和发病条件，是苹果炭疽菌叶枯病病害发生的高峰期。
第二节植物与病原微生物互作的机制
植物虽然在充满多种潜在病原微生物的环境中生长，但是在多数情况下植物并不表现出感病，这表明，植物在与病原微生物共同进化过程中，为了防御病原微生物的入侵，逐渐形成一套天然的免疫系统（Takken et al，2009；Boller et al，2009）。
一、植物对病原微生物侵染的基础抗性(PTI)
研究表明，病原微生物表面存在着一些保守分子，而且很少发生变异，对维持微生物的基本生物学特征非常重要。这些保守的分子特征被称为病原相关分子模式(Pathogen Associated Molecular Patterns，PAMPs)(Jones and Dangl，2006)，例如细菌的鞭毛蛋白(flagellin)。这些保守的分子并非病原微生物所特有，而是广泛的存在于微生物中(Zipfel et al，2008)，所以它们也被称之为微生物相关分子模式(Microbe-associated Molecular Pattern，MAMPs)。真菌的病原相关分子模式主要包括多聚半乳糖醛酸内切酶、麦角甾醇、木聚糖酶以及细胞壁衍生物葡聚糖和几丁质等；细菌的病原相关分子模式主要包括冷激蛋白、脂多糖、延伸因子(EF-Tu)及鞭毛蛋白等，卵菌的病原相关分子模式主要包括β-葡聚糖及转谷氨酰胺酶等(Van et al，2008；Naito et al，2008)。与之相对应，植物的细胞表面存在着识别病原相关分子模式的模式识别受体(Pattern Recognition Receptors，PRRs)。PRRs是一类跨膜蛋白，具有高度的灵敏性和专化性，大都是存在于细胞表面的受体激酶或者具有亮氨酸重复序列的受体样蛋白(LRR-RLP)(Fritz-Laylin et al，2005)。例如，鞭毛蛋白的识别受体FLS2(Gomez-Gomez，et al，2000；Chinchilla，et al，2006)、水稻几丁质酶的识别受体CEBiP(Kaku et al，2006)、延伸因子的识别受体EFR（EF-Tu receptor）(Zipfel et al，2006)、水稻Ax21 的识别受
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