基因工程学（金红星 ）

1973年，美国的科恩(S.Cohen)等将体外重组的DNA分子导入大肠杆菌进行了复制，从此拉开了基因工程的序幕。基因工程在过去50余年中飞速发展，其应用成果已经渗透到农业、工业、医药、国防、能源和环保等诸多领域，成为生物学中发展速度*快、创新成果*多、应用前景*广的一门核心技术。基因工程学课程也已成为国内外高校生物工程(Bioengineering)、生物制药(Biopharmaceutical)、生物技术(Biotechnology)和生物科学(Bioscience)专业本科生的一门专业主干课程。

基因工程学以遗传学、生物化学和分子生物学等学科为基础，引入工程学的一些基本概念，通过周密的实验设计，进行精确的实验操作，高效率地达到预期的目标。为了配合高等学校基因工程的教学，并促进我国生物工程、生物制药、生物技术相关专业人才的培养，特编写了这本教材。

本书的内容具有以下几个特色。

(1)*的生物工程专业(083001)本科教学质量国家标准中要求基因工程课程为32学时，而很多高校的生物工程专业不讲授遗传学且分子生物学的学时短，因此在基因工程中有必要讲解基因和基因组的相关内容，从而为今后的学习和应用奠定坚实的理论基础。

(2)开设生物工程、生物技术、生物制药专业的高校主要是工科院校，而他们的研究领域通常是微生物，因此重点讲述了原核微生物的代表——大肠杆菌和真核微生物的代表——酵母菌的基因工程。另外,*的生物工程专业本科教学质量国家标准中要求开设细胞工程，而这门课程中专门设有一章内容是转基因生物反应器，其中将介绍动植物的基因工程。

(3)简要介绍了第二代基因工程——蛋白质工程(有时称为DNA诱变)和第三代基因工程——途径工程，为遗传育种工作打好理论基础。

(4)在每个基因操作单元都介绍了实验过程中的注意事项，绪论、大肠杆菌和酵母菌的基因工程这三章中都列举了实例，附录中罗列了细菌和酵母的遗传命名指南。

(5)在基因组一章中详细讲述了三代DNA测序和多种基因组定点编辑(同源重组、RecET/Red重组系统、ZFN、TALEN和CRISPR-Cas系统)的原理，为遗传育种工作奠定了理论基础。

(6)详细讲述了分离纯化核酸与克隆基因的基本原理。

(7)简要介绍了合成生物学的研究内容、策略和方法以及应用进展。

编者希望本书能够成为生物工程、生物技术、生物制药专业的本科生的优秀教科书，并能够成为生物技术和生物科学专业本科生和相关专业研究生、工作者的良好参考书。

在编写过程中参考了一些前人的成果与论述，同时也得到了许多朋友和家人的支持，在此表示衷心的感谢！北京盈科千信科技有限公司提供了一些电子版图书作为参考资料，在此表示衷心感谢！河北工业大学化工学院的成文玉为本书绘制插图出力不少，在此表示衷心感谢！本书的编写和出版是在化学工业出版社的大力支持下完成的，在此表示衷心感谢！

编者怀着一颗为基因工程的教学工作尽心尽力的初心，认真负责完成本书的编写。但是，由于编者水平有限，加之时间仓促，书中难免存在疏漏之处，恳请读者和同行批评指正！

编者

2020年夏于北运河畔

E-mail:jinhx87@126.com

《基因工程学》全书共12章，除第1章绪论外，其余各章主要阐述基因、工具酶、载体、重组DNA分子的转化与重组子筛选、核酸的分离纯化与目的基因的克隆、大肠杆菌基因工程、酵母菌基因工程、基因组、蛋白质工程、途径工程和合成生物学等内容。

本书的特色：①以实际操作为抓手，详细论述了基因工程的各个环节以及实验注意事项和实例；②重点讲述了以大肠杆菌为代表的原核微生物和以酵母菌为代表的真核微生物的基因工程技术；③基因组这一章节，详细讲述了三代DNA测序和多种基因组定点编辑(同源重组、RecET/Red重组系统、ZFN、TALEN和CRISPR-Cas系统)的原理，还介绍了与基因组学相关的自然科学和人文科学知识；④以蛋白质工程的实际应用为目标，介绍了基因改造的理性分子设计理论；⑤在讲述途径工程基本原理的基础上，以全新的角度论述了其在实际工作中的应用实例；⑥简要介绍合成生物学，以利于工程菌的准确管控。

《基因工程学》是针对生物工程、生物技术、生物制药专业本科生编写的教材，可供生物技术和生命科学相关专业的本科生使用，也可供研究生和有关科研人员参考。

第1章绪论 / 1

1.1基因工程的基本概念1

1.2基因工程的核心理论和核心技术2

1.2.1基因工程所依赖的核心理论2

1.2.2基因工程所依赖的核心技术2

1.3基因工程的建立与发展2

1.3.1基因工程的建立2

1.3.2基因工程的发展3

1.4基因工程的产业化及应用7

1.4.1基因工程的产业化7

1.4.2基因工程的应用7

1.5转基因生物的安全性与伦理10

1.5.1转基因生物的安全性10

1.5.2转基因生物的伦理12

1.6应用实例13

1.6.1问题的提出13

1.6.2生化产品生产中存在的问题13

1.6.3基因工程的用途13

1.6.4实例14

第2章基因 / 15

2.1孟德尔“遗传因子”:生物性状遗传的符号15

2.2基因:位于染色体上的遗传功能单位15

2.2.1等位基因16

2.2.2复等位基因17

2.3顺反子:一个基因一条多肽18

2.4操纵子:遗传信息传递和表达的统一体20

2.5超基因21

2.6假基因22

2.7断裂基因23

2.7.1RNA剪接24

2.7.2内含子类型26

2.8重叠基因29

2.9可动基因30

2.9.1Ac-Ds系统31

2.9.2插入序列31

2.9.3转座子33

2.9.4P因子37

2.9.5反转录转座子38

2.10癌基因和抑癌基因38

2.11染色体外基因39

2.11.1质粒39

2.11.2线粒体基因40

2.11.3叶绿体基因42

2.11.4非孟德尔遗传42

第3章工具酶 / 44

3.1限制性内切核酸酶44

3.1.1宿主的限制和修饰现象45

3.1.2限制性内切核酸酶的类型45

3.1.3限制性内切核酸酶的命名49

3.1.4影响限制性内切核酸酶活性的因素50

3.1.5限制性内切核酸酶对DNA的消化作用52

3.1.6限制性内切核酸酶反应的终止53

3.1.7限制性内切核酸酶酶切反应的操作步骤和注意事项53

3.2DNA聚合酶54

3.2.1DNA聚合酶Ⅰ（E.coli）54

3.2.2大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段56

3.2.3T4 DNA聚合酶57

3.2.4依赖RNA的DNA聚合酶57

3.2.5T7 DNA聚合酶57

3.2.6修饰的T7 DNA聚合酶58

3.3DNA连接酶58

3.3.1大肠杆菌和T4噬菌体的DNA连接酶58

3.3.2影响连接反应的因素59

3.3.3DNA片段在体内和体外的连接——黏性末端的连接60

3.3.4平末端的连接61

3.3.5连接反应的注意事项64

3.4DNA及RNA的修饰酶64

3.4.1末端脱氧核苷酸转移酶64

3.4.2T4多核苷酸激酶65

3.4.3碱性磷酸酶66

3.5外切核酸酶66

3.5.1外切核酸酶Ⅶ66

3.5.2外切核酸酶Ⅲ67

3.5.3λ外切核酸酶和T7基因6外切核酸酶68

3.6单链内切核酸酶68

3.6.1S1核酸酶68

3.6.2Bal31核酸酶69

3.7细胞裂解酶70

3.7.1溶菌酶70

3.7.2蛋白酶K70

3.7.3纤维素酶70

3.7.4其他裂解酶71

3.8其他71

3.8.1琼脂糖酶71

3.8.2核酸酶抑制剂71

第4章载体 / 72

4.1质粒载体72

4.1.1质粒的一般生物学特性73

4.1.2质粒载体的选择76

4.1.3常用的大肠杆菌质粒载体78

4.2噬菌体载体86

4.2.1单链噬菌体载体86

4.2.2双链噬菌体载体90

4.3黏粒载体95

4.3.1黏粒载体的组成96

4.3.2黏粒载体的特点96

4.3.3黏粒载体的应用96

4.4噬菌粒载体97

4.4.1噬菌粒载体的概念97

4.4.2pUC118和pUC119噬菌粒载体98

4.4.3pBluescript噬菌粒载体98

4.5人工染色体载体100

4.5.1酵母人工染色体载体100

4.5.2细菌人工染色体载体101

4.5.3P1人工染色体载体103

第5章重组DNA分子的转化与重组子筛选 / 104

5.1DNA分子的转化与扩增104

5.1.1DNA重组转化的基本概念104

5.1.2受体细胞的选择105

5.1.3转化方法107

5.1.4转化率及影响因素110

5.1.5转化细胞的扩增111

5.1.6进行转化时的注意事项112

5.2重组体克隆的筛选与鉴定112

5.2.1遗传检测法112

5.2.2物理检测法116

5.2.3核酸杂交法119

5.2.4PCR检测法122

5.2.5克隆基因定位法122

5.2.6测序检测法124

5.2.7外源基因表达产物检测法125

第6章核酸的分离纯化与目的基因的克隆 / 128

6.1核酸的分离纯化128

6.1.1核酸分离提取的原则128

6.1.2核酸的分离提取129

6.1.3质粒DNA的提取132

6.1.4RNA的提取133

6.1.5核酸的检测134

6.2目的基因的克隆136

6.2.1鸟枪法137

6.2.2cDNA法139

6.2.3PCR扩增法143

6.2.4化学合成法153

6.2.5基因文库的构建156

第7章大肠杆菌基因工程 / 159

7.1外源基因在大肠杆菌高效表达的原理159

7.1.1启动子159

7.1.2终止子165

7.1.3核糖体结合位点165

7.1.4密码子166

7.1.5质粒拷贝数168

7.2大肠杆菌工程菌的构建策略169

7.2.1包涵体型异源蛋白的表达170

7.2.2分泌型异源蛋白的表达174

7.2.3融合型异源蛋白的表达175

7.2.4寡聚型异源蛋白的表达179

7.2.5整合型异源蛋白的表达182

7.2.6蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建183

7.3重组异源蛋白的体外复性活化185

7.3.1蛋白质变性的动力学原理185

7.3.2折叠中间状态分子的聚结作用186

7.3.3包涵体的溶解与变性187

7.3.4异源蛋白的复性与重折叠189

7.4基因工程菌的遗传不稳定性及其对策195

7.4.1基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制195

7.4.2改善基因工程菌不稳定性的策略196

7.5大肠杆菌基因工程的案例198

第8章酵母菌基因工程 / 203

8.1酵母菌的宿主系统203

8.1.1提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌203

8.1.2抑制超糖基化作用的突变宿主菌204

8.1.3减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌205

8.1.4内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主菌206

8.2酵母菌的载体系统206

8.2.1酿酒酵母的2μ环状质粒206

8.2.2乳酸克鲁维酵母的线型质粒208

8.2.3果蝇克鲁维酵母的环状质粒208

8.2.4含ARS的YRp和YEp209

8.2.5含CEN的YCp210

8.2.6穿梭载体211

8.3酵母菌的转化系统212

8.3.1酵母菌的转化程序212

8.3.2转化质粒在酵母细胞中的命运213

8.3.3用于转化子筛选的标记基因214

8.4酵母菌的表达系统216

8.4.1酵母菌启动子的基本特征与选择216

8.4.2酵母菌启动子的可调控表达系统217

8.4.3外源基因在酵母菌中表达的限制因素219

8.4.4酵母菌表达系统的选择220

8.5酵母菌基因工程的案例222

第9章基因组 / 225

9.1基因组测序225

9.1.1DNA测序方法225

9.1.2基因组序列测定234

9.1.3序列组装236

9.2功能基因组学240

9.2.1组学简介241

9.2.2转录物组241

9.2.3蛋白质组242

9.2.4基因组学发展的趋势243

9.2.5基因组学应用244

9.2.6基因组伦理学246

9.3基因组表观遗传248

9.3.1表观遗传248

9.3.2位置效应249

9.3.3DNA甲基化250

9.3.4染色体重建250

9.4基因组编辑251

9.4.1遗传重组252

9.4.2基因敲除257

9.4.3新一代的基因组定点编辑技术261

第10章蛋白质工程 / 275

10.1蛋白质工程的基本概念275

10.1.1蛋白质工程的基本特征275

10.1.2蛋白质工程的研究内容和应用276

10.1.3蛋白质工程实施的必要条件276

10.2实际工作中的蛋白质工程277

10.2.1基因的体外定向突变277

10.2.2基因的体外定向进化277

10.2.3突变文库的筛选模型278

10.2.4蛋白质工程的设计思想278

10.2.5蛋白质基因改造的理性分子设计279

第11章途径工程 / 287

11.1途径工程的基本概念287

11.1.1途径工程的基本定义287

11.1.2途径工程的基本过程288

11.1.3途径工程的基本原理290

11.2途径工程的研究策略291

11.2.1在现存途径中提高目标产物的代谢流292

11.2.2在现存途径中改变物质流的性质293

11.2.3利用已有途径构建新的代谢旁路294

11.3途径工程的应用实例294

11.3.1明串珠菌发酵产甘露醇294

11.3.2乳酸乳球菌发酵产甘露醇297

11.3.3在木质纤维素生物炼制中的应用297

11.3.4细胞性能的改进298

第12章合成生物学 / 301

12.1概述301

12.2合成生物学概念302

12.3合成生物学研究的核心内容304

12.3.1生物成分标准模块化设计和构建305

12.3.2中心法则再设计和构建306

12.3.3生物网络的设计和构建308

12.3.4底盘基因组的设计和构建312

12.3.5基因组合成313

12.4合成生物学的研究策略和方法314

12.4.1合成策略和方法315

12.4.2分析策略和方法321

12.5合成生物学的应用研究323

12.5.1设计和构建新的生物大分子323

12.5.2设计和构建新的途径/网络324

12.5.3合成传感器325

12.5.4合成生物学用于药物发现、生产和治疗327

12.5.5合成生物学用于控制代谢流量328

12.5.6工程细胞329

12.5.7合成生态系统330

12.6设计与构建新的遗传系统331

12.7合成生物学面临的问题和挑战332

12.7.1表征、标准化和模块化332

12.7.2噪声的处理332

12.7.3表观遗传332

12.7.4计算工具332

12.7.5程序化抽提333

12.7.6合成生物学结果的处理333

12.7.7部件不相容问题333

12.8社会及伦理问题333

12.9小结334

附录 / 335

附录一遗传命名指南335

附录二常见的克隆方法341

附录三实验过程中的注意事项342

附录四实验室成员的基本素质与行为准则346

附录五提取高质量RNA的技巧349

参考文献 / 352