重组鸡白细胞介素18的基因表达及其免疫原研究
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作者孔娜，王新华，蒋培红
出版社中国农业科学技术出版社
ISBN9787511641243
出版时间2019-04
装帧平装
开本32开
定价20元
货号1201884346
上书时间2024-10-18
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商品详情
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作者简介
孔娜，女，博士，讲师，毕业于山东农业大学，就职于菏泽学院。主要从事微生物学与免疫学的研究。工作以来，共主持和参与项目3项，其中省部级1项，校级2项。以独立作者发表科研论文8篇，其中SCI收录2篇。以独立作者获得菏泽市自然科学很好学术成果奖1项(二等奖)等。指导学生团队在第五届全国“生泰尔杯”大学生动物医学专业技能比赛荣获一等奖，被评为很好指导老师。获山东省第五届“超星杯”高校青年教师教学比赛很好奖等。
目录
概述()一、白细胞介素18的研究进展（）二、鸡IL-18的研究进展（）三、鸡IL-18对传染性法氏囊病疫苗免疫原性提高的研究进展（）四、鸡IL-18对禽流感免疫原性提高的研究进展（）五、鸡IL-18在杆状病毒表达系统中表达的研究进展（）第一章ChIL-18原核表达蛋白复性研究()第一节不同复性方法对rChIL-18原核表达蛋白复性率和生物学活性的影响（）一、材料（）二、方法（）三、结果（）四、讨论（）第二节人工分子伴侣系统辅助rChIL-18原核蛋白复性过程中影响因素的研究（）一、材料（）二、方法（）三、结果（）四、讨论（）第二章rChIL-18原核蛋白及真核表达质粒对IBDV灭活疫苗免疫增强作用的研究()一、材料（）二、方法（）三、结果（）四、讨论（）第三章mChIL-18与IBDV VP2基因或AIV HA1基因在pFastBacual中的共表达及其免疫原性研究()第一节mChIL-18与VP2或HA1在杆状病毒表达载体中的共表达（）一、材料（）二、方法（）三、结果（）四、讨论（）第二节双表达产物pF-IL18-VP2和pF-IL18-HA1的生物学活性检测（）一、材料（）二、方法（）三、结果（）四、讨论（）第三节双表达蛋白pF-IL18-VP2和pF-IL18-HA1的免疫原性研究（）一、材料（）二、方法（）三、结果（）四、讨论（）研究结果()相关文章()参考文献()符号说明()附录()
内容摘要
白细胞介素18(Interleukine-18, IL-18)是一种多效细胞因子，具有强烈的IFN-γ诱生能力，对机体起着重要的免疫调节和保护作用，在抗微生物感染、抗肿瘤免疫中具有应用潜力，因此IL-18可作为免疫佐剂与一些病原微生物的保护性基因共表达，从而加强疫苗的免疫效果或制备基因工程疫苗；由于鸡IL-18(ChIL-18)基因发现得比较晚，而对人和哺乳动物IL-18的研究已有许多报道，且其具有与人和哺乳动物相似的生物学功能，因此ChIL-18在比较免疫学研究和禽病治疗中具有重要意义。pFastBacual载体含有PH启动子和p10启动子，可以同时表达两个具有独立活性的外源蛋白。杆状病毒对脊椎动物无病原性，也不能在脊椎动物细胞内复制、表达，更不能把其基因整合到脊椎动物细胞染色体内，因此重组杆状病毒可以被认为遗传学上是安全的表达载体；外源基因因插入多角体蛋白基因的座位引起后者的缺失或灭活，因此重组病毒不产生包涵体，这不仅为重组病毒选择提供了标记，而且重组不能像野生型病毒那样在环境中长期存在，所以更安全。故本研究直接将未纯化的双表达蛋白进行免疫原性研究。
精彩内容
前言白细胞介素18(Interleukine-18,IL-18)是一种多效细胞因子，具有强烈的IFN-γ诱生能力，对机体起着重要的免疫调节和保护作用，在抗微生物感染、抗肿瘤免疫中具有应用潜力，因此IL-18可作为免疫佐剂与一些病原微生物的保护性基因共表达，从而加强疫苗的免疫效果或制备基因工程疫苗；由于鸡IL-18(ChIL-18)基因发现较晚，而对人和哺乳动物IL-18的研究已有许多报道，且其具有与人和哺乳动物相似的生物学功能，因此ChIL-18在比较免疫学研究和禽病治疗中具有重要意义。pFastBacTM Dual载体含有PH启动子和p10启动子，可以同时表达两个具有独立活性的外源蛋白。杆状病毒对脊椎动物无病原性，也不能在脊椎动物细胞内复制、表达，更不能把其基因整合到脊椎动物细胞染色体内，因此重组杆状病毒可以被认为遗传学上安全的表达载体。外源基因因插入多角体蛋白基因的座位引起后者的缺失或灭活，因此重组病毒不产生包涵体，这不仅为重组病毒选择提供了标记，而且重组不能像野生型病毒那样在环境中长期存在，所以更安全。故本研究直接将未纯化的双表达蛋白进行免疫原性研究。传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由IBD 病毒(IBDV)感染雏鸡引起的以淋巴组织，特别是中枢免疫器官——法氏囊为主要特征的高度接触性传染病。该病主要导致机体免疫抑制，使机体的免疫能力降低和疫苗免疫接种失败。虽然灭活疫苗和减毒活疫苗是相当成熟的，但由于IBDV强毒株和抗原变异的出现使其免疫效价降低。VP2 是IBDV的主要保护性抗原，已经鉴定的IBDV中和表位主要在VP2 上，并且多为构象依赖性，这意味着VP2 的立体结构对其中和表位的形成至关重要，与病毒中和抗体的诱导、抗原和毒力的变异以及细胞凋亡的诱导等有关。禽流感(Avian influenza,AI)是由AI病毒(AIV)感染引起的一种高度接触性人畜共患传染病。HPAI 的暴发给养禽业带来了一定的经济损失，H5N1亚型AI的出现不仅产生经济损失，还带来了恐慌。AIV的主要抗原决定簇都位于HA1区域。体外表达HA1涵盖了所有的HA空间中和表位，故其接近可以替代HA作为抗原。所以HA1蛋白是研制基因工程亚单位苗的理想候选抗原。本试验利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，选用pFastBacTM Dual双表达载体，在昆虫细胞表达mChIL-18基因蛋白和IBDV VP2基因蛋白或H5型AIV HA1基因蛋白，并对未纯化蛋白生物学活性进行分析；进而研究未纯化蛋白免疫原性。为进一步研究VP2基因工程疫苗、HA1基因工程疫苗的免疫效果以及mChIL-18在IBD、AI的免疫调节作用等相关研究奠定基础。一、ChIL-18原核表达蛋白复性研究研究利用不同的复性方法辅助rChIL-18原核表达蛋白的复性，以提高鸡IL-18重组蛋白复性率，获得更多具有良好活性的蛋白。将重组原核表达质粒pGEX-mChIL-18转化宿主细胞大肠杆菌BL21（DE3），并用IPTG于37℃诱导培养获得表达。表达产物主要以包涵体的形式存在。包涵体经超声波破碎、洗涤后以6mol/L的盐酸胍溶解，使蛋白变性,然后利用盐酸胍-去离子水透析法、盐酸胍-谷胱甘肽变性复性法和人工分子伴侣系统法分别辅助蛋白复性。复性产物经透析纯化后，利用淋巴细胞增殖试验来检测其活性。经SDS-PAGE分析表明,表达产物是与ChIL-18重组蛋白相符的Mr约44000的蛋白条带。利用人工分子伴侣系统辅助复性的方法获得的复性率优选，复性率为4254％。鸡淋巴细胞增殖试验表明,表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导增殖作用。上述试验显示，人工分子伴侣系统能够较好地辅助鸡IL-18重组蛋白复性，获得较高的复性率。其产物具有良好的生物学活性,为下一步鸡IL-18重组蛋白的应用研究奠定了试验基础。将重组原核表达质粒pGEX-mChIL-18转化宿主细胞大肠杆菌BL21（DE3），并用IPTG于37℃诱导培养获得表达。表达的包涵体经超声波破碎、洗涤后以6mol/L的盐酸胍溶解，使蛋白变性。然后按照试验设计，考察不同浓度组成的人工分子伴侣体系对不同浓度鸡IL-18重组蛋白复性率的影响。试验结果表明，利用人工分子伴侣系统辅助鸡IL-18重组蛋白的复性存在很好的条件，优化该条件能够提高该融合蛋白的复性率，且产物都具有良好的生物学活性，为鸡IL-18重组蛋白的进一步应用研究奠定了试验基础。二、鸡IL-18原核表达蛋白及真核表达质粒对IBDV灭活疫苗免疫增强作用的研究本研究室在2001年开展鸡白细胞介素18（ChIL-18）的研究，先后构建ChIL-18的重组质粒和原核表达系统、真核质粒及其表达系统，在此基础上，对纯化后的原核表达的重组鸡白细胞介素18产物进行生物学活性检测，对其在生产中的应用做了初步研究，同时对影响ChIL-18原核表达产物生物学活性的因素也进行了探讨。将鸡IL-18原核表达蛋白的复性产物和真核表达质粒pcDNA31TOPO-mChlL18分别与IBDV灭活疫苗联合应用，通过中和抗体检测和T淋巴细胞对ConA增殖反应试验，研究其对IBDV灭活疫苗的免疫增强作用。结果显示，在接种后第21、28、35及42天时蛋白组和质粒组与单纯疫苗组抗体水平差异显著（P<005）,且蛋白组比质粒组效果更明显一些；其T淋巴细胞的增殖反应也强于单纯疫苗组，尤其是在免疫14天后增殖效果明显高于单纯疫苗组（P<005）。接种42d后进行攻毒保护性试验，结果表明：同时接种鸡IL-18原核表达蛋白复性产物和真核表达质粒的试验组鸡获得933％的保护率，而单纯疫苗接种组的保护率为733％。鸡IL-18的原核表达蛋白和真核表达质粒均具有明显的增强IBD灭活疫苗免疫效果的作用。三、mChIL-18与VP2或HA1在杆状病毒表达载体中的共表达分别以pMD18-T-VP2、pMD18-T-HA1和pMD18-T-mChIL18质粒为模板，以杆状病毒pFastBacTM Dual为载体，将mChIL18基因与VP2基因或HA1基因分别插入到载体的PH启动子和P10启动子的下游，构建重组转移载体质粒pF-IL18、pF-VP2、pF-IL18-VP2、pF-HA1、pF-IL18-HA1。将其转化DH10Bac感受态细胞，经三重抗性(含卡那霉素、庆大霉素和四环素)与蓝白斑筛选，用小量法提取重组杆状病毒质粒rBac-IL18、rBac-VP2、rBac-IL18-VP2、rBac-HA1、rBac-IL18-HA1，通过一对通用引物M13(Bacmid含有该引物Forward和Reverse两个引物位点，能够从两侧扩增LacZα互补区域内的mini-attTn7位点，有利于PCR分析)进行PCR扩增鉴定。在转染试剂Cellfectin II的作用下，通过脂质体介导法将纯化的rBac-IL18、rBac-VP2、rBac-IL18-VP2、rBac-HA1、rBac-IL18-HA1转染至草地贪夜蛾细胞(Spodoptera frugiperda 9，sf9)获得P1代重组杆状病毒，用P1代病毒感染sf9来扩增病毒滴度，将达到一定滴度(107～108pfu/mL)的P3代重组杆状病毒感染sf9，感染72h后收获sf9细胞及培养上清，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测和间接免疫荧光试验(IFA)检测。SDS-PAGE检测显示，mChIL-18、VP2、HA1基因均在sf9中的裂解上清中得到了高效表达，即表达的蛋白是可溶性的，表达的目的条带分子量分别约为195 KD,484 KD,374 KD。IFA检测显示mChIL18基因与VP2基因或HA1基因分别同时在同一细胞中独立表达。四、双表达产物pF-IL18-VP2和pF-IL18-HA1的生物学活性检测采用鸡脾淋巴细胞增殖试验(MTT法)、IFN-γ诱导实验和水疱性口炎病毒(VSV)抑制试验对表达的蛋白进行生物学活性测定。鸡脾淋巴细胞增殖试验表明，不同浓度的pIL18、pVP2-IL18 和pHA1-IL18均能够明显促进淋巴细胞的增殖，随着蛋白浓度的增加刺激转化作用逐渐增强，均当浓度为200ng/mL时，刺激转化效果很好，增殖指数可达413、435、409，但随着蛋白浓度的增大淋巴细胞的增殖指数逐渐降低。VSV病毒活性抑制试验表明，当蛋白浓度大于100ng/mL时能刺激脾淋巴细胞产生IFN-γ，并且随着pIL18、pVP2-IL18 和pHA1-IL18浓度的增加诱导产生IFN-γ的量随之增加；将不同稀释度的IFN-γ分别作用于VSV，在IFN-γ≥1×102U/mL时，具有较强的抑制效果，当IFN-γ为10 U/mL时，只能达到约50%的保护。该结果说明pIL18、pVP2-IL18 和pHA1-IL18的抗病毒活性是通过IFN-γ实现的，且在一定浓度范围内具有抑制VSV病毒产生细胞病变的作用。五、双表达蛋白pF-IL18-VP2和pF-IL18-HA1的免疫原性研究将含有pIL18、pVP2、pVP2-IL18的油乳剂疫苗分组免疫动物，14d时一免，28d时二免。Ⅰ组为传统疫苗组；Ⅱ组为pIL18与B78减毒疫苗联合疫苗组；Ⅲ为pIL18与pVP2联合疫苗组；Ⅳ组为pVP2-IL18单独免疫组；Ⅴ组一免注射B78减毒疫苗，二免注射pVP2-IL18；Ⅵ组为pVP2单独免疫组；Ⅶ组为对照组。从体液免疫和细胞免疫水平上分析试验结果。细胞免疫水平通过流式细胞术检测，从统计学意义上分析处理数据。结果表明，与免疫前和阴性对照组相比，各试验组都促进CD4+和CD8+ T细胞增殖。一免后各试验组CD4+ T细胞都呈上升趋势，但一免7d后又呈下降趋势；二免后Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ呈上升趋势且持续时间比较长，其中Ⅳ组CD4+ T增殖水平优选，在一免后21d、28d、35d都与其他组差异显著(P<005)。一免后各试验组CD8+ T细胞都呈上升趋势，但一免7d后又呈下降趋势；二免后各实验组仍呈不同下降趋势，其中Ⅰ组CD8+ T增殖水平优选，在一免后14d、21d、28d都与其他组差异显著(P<005)。体液免疫水平通过使用传染性法氏囊病病毒抗体检测试剂盒检测，从统计学意义上分析处理数据。结果表明，与免疫前相比，各试验组都有较好的促进IBD抗体生成作用，抗体水平都持续增高且维持时间也较长，都在在一免后28d抗体水平达到优选；与阴性对照组相比，Ⅳ组效果优选，抗体效价优选，Ⅴ组次之,然后是Ⅱ组、Ⅰ组、Ⅲ组、Ⅵ组。攻毒试验结果表明，Ⅳ组保护率可达90%，Ⅴ组次之可达80%，然后是Ⅰ组和Ⅱ组75%、Ⅲ组为70%、Ⅵ组50%，Ⅶ组无一幸免。将含有pIL18、pHA1、pHA1-IL18的油乳剂疫苗分组免疫动物，7d时一免，21d时二免。Ⅰ组为传统疫苗组；Ⅱ组为pIL18与传统疫苗联合疫苗组；Ⅲ为pHA1单独免疫组；Ⅳ组为pHA1-IL18单独免疫组；Ⅴ组pIL18与pHA1联合疫苗组；Ⅵ组为pHA1单独免疫组；Ⅶ组为对照组。从体液免疫和细胞免疫水平上分析试验结果。细胞免疫水平通过流式细胞术检测。结果表明，与免疫前和阴性对照组相比，各试验组都能够明显促进CD4+和CD8+ T细胞的增殖反应：一免后各试验组CD4+ 和CD8+T细胞都呈上升趋势，但一免7d后又呈下降趋势；二免后虽呈上升趋势且持续时间比较长，但增殖幅度不大，以Ⅳ组CD4+ T增殖水平优选。体液免疫水平通过使用血凝抑制试验检测。结果表明，各试验组都有较好的促进ND、H5型AI和H9型AI抗体生成作用，都是在一免后28d抗体水平达到优选；与阴性对照组相比，Ⅳ组效果优选，抗体效价优选与其他组差异显著(P<005)。著者2019年3月
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