基因工程（袁婺洲）（第二版）

前言

《基因工程》版教材已经使用九年了。九年的时间，基因工程技术的发展日新月异，某些新技术和新进展甚至出现井喷式的发展与更替。早该将这些新技术和新进展写进教材，但由于各种原因，《基因工程》第二版的修订和编写工作较为缓慢，在这里对支持和热爱本教材的读者们致以深深的歉意。

《基因工程》第二版的修订和撰写工作主要从三个方面着手。一是订正版的错误。由于版教材编写匆忙，教材付印后发现有几处明显的小错误，在第二版已经得到更正。二是重新绘制了教材中原有的全部插图，并增加了较多原创的新插图，统一了插图的风格。对于教材中涉及的基因工程原理和技术，力求用更直观易懂的插图形式进行诠释，让读者更容易理解并加深印象。全部插图的电子版都可以在数字课程网站获取。其中基因工程载体一章，在教材中呈现的大多是载体的结构示意图，数字课程网站还补充了许多载体的详细结构图电子版，供学习者使用参考。第二版教材内容更新的第三个方面，是增加了基因工程技术近几年的进展和应用，如“Golden Gate”一步克隆法、无缝连接克隆快线、新一代DNA测序技术、iPS与体细胞克隆技术、TALEN和CRISPR基因编辑技术、CART免疫治疗等。尤其是对有关高通量测序、基因编辑和免疫治疗技术的发展历程和进展，本教材进行了较全面的阐述和展望，“新”意十足，也饶有趣味。

教材第二版的架构略有调整，共分10章，主要是根据转基因操作的程序为主线，先介绍了基因工程操作的两大工具，接着阐述了目的基因获取的主要途径以及目的基因导入受体细胞和阳性转化子鉴定的主要方法，后介绍了基因工程在基因功能研究、转基因植物、转基因动物和基因治疗等方面的应用及进展，其中以基因功能研究技术为重点。参加第二版教材编写的人员依然是湖南师范大学“基因工程”教学团队，其中邓云教授修改了第2章和第3章的部分内容，李东屏教授修改了第8章，范雄伟副教授倾情撰写了第7章、第9章和第10章的内容，其中CRISPR系统和CART免疫治疗部分的综述让本教材妙趣横生。万永奇副教授提供了部分参考文献。袁婺洲教授修订和撰写了第二版教材的全部章节以及每章的章前导读与章后小结，并负责全书的提纲、统筹、组织、修订、插图绘制、创作与整理、书稿审查和校对等工作。在此对所有编写人员表示感谢！

第二版教材的插图绘制经过了几年时间的积累，其中湖南师范大学2013届生物科学专业和2015级生物技术专业及基地班的许多本科生同学参与了部分创作与绘制工作，在此也对这些同学的付出表示感谢！

本教材的编写和出版是在化学工业出版社的大力支持下完成的，感谢化学工业出版社的信任与支持。

本教材的出版也得到基因工程国家精品课程建设项目、基因工程国家精品资源共享课建设项目以及基因工程湖南省精品在线开放课程建设项目和湖南师范大学精品在线开放课程建设项目的资助和支持。

与教材内容配套的慕课短视频也制作完成，由袁婺洲教授、范雄伟副教授以及万永奇副教授讲授，已在智慧树和爱课程网在线开放。欢迎读者同步使用教材和慕课短视频进行学习。

限于经验、学识和水平，尽管已反复校订，但书中不足之处在所难免，恳请读者和同行继续不吝指教为谢。

袁婺洲

2019年6月于岳麓山下

版前言

基因工程技术自1973年诞生之后，以惊人的速度飞速发展，其应用成果已经渗透到人们生活和工农业生产的各个领域，成为生物技术中发展速度快、创新成果多、应用前景广的一门核心技术。基因工程课程也已成为国内外高校生物技术和生物科学专业本科生的一门专业主干课程。

湖南师范大学生命科学学院自1997年开始为硕士研究生开设基因工程课程，是全院一门硕士研究生的专业基础课程。2002年开始为生物技术专业和国家生命科学技术人才培养基地的本科生开设基因工程专业课，现在授课对象已经扩展到了生物科学专业和树达学院生物技术专业的本科生。2008年，湖南师范大学基因工程本科教学项目相继获得学校和湖南省教育厅的精品课程建设立项，2009年获得国家*的精品课程建设立项。2006年之前，我们一直使用马建岗编写的《基因工程原理》作为教材，2006年以后选用了李立家和肖庚富编著的《基因工程》教材。为了配合《基因工程》国家精品课程的建设，及时跟踪学科发展前沿，我们于2009年底开始着手编写这一本新的《基因工程》教材。

如今，生命科学已经进入功能基因组时代。基因工程在现阶段的主要特色就是基因工程技术与功能基因组学的完美结合与相互促进，因此本教材的主要特点就是次详细介绍了基因工程在基因功能研究中的应用，而功能基因组研究的需求又促使基因工程技术不断向前沿发展。对于师范类高校和综合性大学的生命科学相关专业的本科生来说，目前国内的就业去向主要有两个，一是去国内外高校和科研院所继续深造、读研和攻博，二是去大专院校、科研院所以及生物制剂和制药公司从事教学、科研、研发和销售工作。不管哪一种去向，大部分的工作内容都会或多或少与基因工程及功能基因组学的研究技术打交道，因此本教材将基因工程技术与功能基因组学结合起来也适应了大学生就业的市场需求。

本教材共8章，由湖南师范大学生命科学学院基因工程本科教学团队的教师们编写完成。袁婺洲教授负责全书的提纲拟定、统筹、组织、编写、修订、图片收集、扫描、绘制与整理、章前导读与章后小结的撰写、书稿审查和校对等工作，并独立编写了教材第1章、第3章、第7章和第8章的内容，第2章由邓云副教授编写，第5章由李东屏副教授编写，第4章由万永奇博士编写，第6章由唐文岘讲师编写，博士研究生周军媚参与了第3章计算机克隆目的基因内容的编写工作。教材编写过程中得到了吴秀山教授和生命科学学院领导的支持。在此对所有编写人员及支持本书编写的所有老师和同学表示感谢！

本书的编写和出版是在化学工业出版社刘畅编辑的督促下启动和完成的，与刘畅编辑的多次愉快的交流让本书由设想变为现实。感谢刘畅编辑的信任与支持！

本书的出版得到基因工程国家精品课程建设项目、基因工程湖南省精品课程建设项目、湖南师范大学精品课程建设项目以及湖南师范大学出版基金的资助。同时感谢化学工业出版社的大力支持！

限于经验和水平，加之时间仓促，书中错漏定有不少，恳请读者和同行批评指正！

袁婺洲

2010年5月于岳麓山下

    《基因工程》第二版为国家精品课程建设教材、国家精品资源共享课教材，与教材配套有慕课视频可供学习。

    本教材主要内容包括三部分：一是基因工程的基本原理与基本技术，涉及工具酶和基因工程载体及常用的基因表达系统，目的基因获取、制备、扩增、导入与鉴定的各种方法。二是基因工程用于功能基因组学研究的技术，包括基因表达谱研究技术、全基因组化学诱变和转座子饱和诱变技术、基因敲除与基因敲减技术、过表达和异位表达技术、染色质沉淀等基因相互作用研究技术等，第二版还大篇幅增加了TALEN和CRISPR基因编辑技术的发展历史和*进展。三是基因工程在工农业生产和医学研究中的应用，包括转基因植物、转基因动物的制备与应用，转基因安全评价与监管，基因治疗的原理、策略与研究进展。

    本教材可用作国内高等院校及科研院所生物科学、生物技术、生物工程及基础医学和制药专业的本科生、研究生及科研人员学习的教材和参考书，也可作为对转基因技术和基因工程感兴趣的其他领域人士科普学习的参考书。

 《基因工程》第二版为国家精品课程建设教材、国家精品资源共享课教材，与教材配套有慕课视频可供学习。

 本教材主要内容包括三部分：一是基因工程的基本原理与基本技术，涉及工具酶和基因工程载体及常用的基因表达系统，目的基因获取、制备、扩增、导入与鉴定的各种方法。二是基因工程用于功能基因组学研究的技术，包括基因表达谱研究技术、全基因组化学诱变和转座子饱和诱变技术、基因敲除与基因敲减技术、过表达和异位表达技术、染色质沉淀等基因相互作用研究技术等，第二版还大篇幅增加了TALEN和CRISPR基因编辑技术的发展历史和*进展。三是基因工程在工农业生产和医学研究中的应用，包括转基因植物、转基因动物的制备与应用，转基因安全评价与监管，基因治疗的原理、策略与研究进展。

 本教材可用作国内高等院校及科研院所生物科学、生物技术、生物工程及基础医学和制药专业的本科生、研究生及科研人员学习的教材和参考书，也可作为对转基因技术和基因工程感兴趣的其他领域人士科普学习的参考书。

袁婺洲，湖南师范大学生命科学院教授，博士生导师。1988年毕业于北京师范大学生物学系，1994年获湖南农业大学遗传学专业博士学位。美国密西根大学博士后，英国伦敦大学学院高级研究学者。自1994年起在湖南师范大学生命科学学院从事《基因工程》和《遗传学》等课程的教学工作。主持《基因工程》国家精品课程及国家精品资源共享课程各1项，湖南省精品在线开放课程1项。主编教材2部，合编教材3部。获“第11届全国多媒体课件大赛”二等奖1项，湖南师范大学教学成果一等奖2项，教学奖5项。主编的《基因工程》教材获2012年中国石油和化学工业出版物奖（教材奖）二等奖。研究方向是利用动物模型研究人类心脏发育及心血管疾病基因的功能与调控机制。主持国家自然科学基金项目5项、*新世纪人才支持计划1项及省级课题多项。在国内外杂志发表研究论文120多篇，合作出版专著4部。获湖南省科技进步一等奖1项、湖南省自然科学奖一等奖1项、第五届湖南省青年科技奖1项、湖南省“芙蓉百岗明星”1项。

1基因工程概述/ 001

1.1基因工程的概念与基本流程/ 001

1.1.1基因工程的概念/ 001

1.1.2基因工程的基本流程/ 002

1.2基因工程的发展简史/ 003

1.2.1基因工程诞生的背景/ 003

1.2.2基因工程的诞生/ 004

1.2.3基因工程的发展/ 006

1.3基因工程的研究意义和应用/ 007

1.3.1基因工程在功能基因组学研究中的应用/ 007

1.3.2基因工程在工业领域的应用/ 008

1.3.3基因工程在农业领域的应用/ 009

1.3.4基因工程在医药领域的应用/ 011

本章小结/ 013

复习题/ 013

2基因工程工具酶/ 014

2.1限制性核酸内切酶/ 014

2.1.1限制性核酸内切酶的发现和种类/ 014

2.1.2限制性核酸内切酶的命名/ 016

2.1.3限制性核酸内切酶的特征/ 016

2.1.4限制性核酸内切酶的同尾酶/ 018

2.1.5影响限制性核酸内切酶酶切反应的因素/ 020

2.1.6限制性核酸内切酶酶切位点的引入与消失/ 022

2.2DNA连接酶/ 023

2.2.1DNA连接酶的作用/ 023

2.2.2不同末端的连接策略/ 025

2.2.3影响DNA连接反应的因素/ 027

2.3DNA聚合酶类/ 029

2.3.1大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ/ 029

2.3.2Klenow大片段酶/ 030

2.3.3耐热的DNA聚合酶Taq/ 030

2.3.4T4噬菌体DNA聚合酶/ 031

2.3.5逆转录酶/ 032

2.4碱性磷酸酶/ 033

2.4.1碱性磷酸酶防止载体自连/ 033

2.4.2获得5′末端磷酸基团标记的探针/ 036

2.5末端脱氧核苷酸转移酶/ 036

2.6其他工具酶/ 037

2.6.1Ⅱs型限制性核酸酶/ 038

2.6.2Cas核酸内切酶/ 039

2.6.3Dicer酶/ 039

2.6.4重组酶/ 040

本章小结/ 043

复习题/ 043

3基因工程载体/ 044

3.1克隆载体/ 044

3.1.1质粒载体/ 045

3.1.2噬菌体载体/ 053

3.1.3黏粒载体/ 057

3.1.4人工微小染色体/ 058

3.2表达载体/ 060

3.2.1原核表达载体/ 060

3.2.2真核表达载体/ 072

本章小结/ 076

复习题/ 076

4目的基因的获取与制备/ 077

4.1从基因文库获取目的基因/ 078

4.1.1基因组文库的构建与筛选/ 078

4.1.2cDNA基因文库的构建与筛选/ 083

4.2电子克隆法获取目的基因/ 092

4.2.1利用EST数据库进行电子克隆/ 093

4.2.2利用基因组数据库进行电子克隆/ 093

4.2.3全长cDNA 的判断/ 094

4.2.4电子克隆基因的生物信息学分析/ 095

4.3PCR 获取与扩增目的基因/ 095

4.3.1常规PCR/ 095

4.3.2反向PCR/ 102

4.3.3反转录PCR/ 104

4.3.4实时荧光定量PCR/ 105

4.3.5多重PCR/ 110

4.3.6巢式PCR/ 113

4.3.7不对称PCR/ 113

4.3.8RACEPCR/ 114

4.3.9原位PCR/ 114

4.4通过蛋白质工程改建目的基因/ 116

4.4.1蛋白质工程的概念/ 116

4.4.2蛋白质工程的定点突变技术/ 117

4.4.3蛋白质工程的定向进化技术/ 121

本章小结/ 123

复习题/ 124

5目的基因导入受体细胞的方法/125

5.1把目的基因导入大肠杆菌/ 126

5.1.1自然条件下的转化过程/ 126

5.1.2感受态受体细胞的选择/ 128

5.1.3外源目的基因转化进入大肠杆菌细胞的方法/ 129

5.1.4外源基因通过噬菌体转导进入受体细胞/ 131

5.2把目的基因导入酵母细胞/ 133

5.2.1聚乙二醇介导的酵母转化/ 133

5.2.2金属阳离子介导的酵母转化/ 134

5.3把目的基因导入植物细胞/ 134

5.3.1DNA直接转移法/ 135

5.3.2农杆菌Ti质粒载体介导法/ 137

5.4把目的基因导入动物细胞/ 141

5.4.1外源基因导入离体培养的动物细胞/ 142

5.4.2外源基因导入在体动物细胞/ 144

本章小结/ 147

复习题/ 147

6阳性转化子的鉴定/148

6.1遗传表型检测法/ 148

6.1.1利用载体提供的表型特征筛选和鉴定重组DNA分子/
149

6.1.2利用外源目的基因本身的序列提供的表型特征筛选/ 153

6.2酶切电泳检测/ 155

6.2.1凝胶电泳检测筛选/ 155

6.2.2限制性核酸内切酶酶切分析筛选/ 156

6.3核酸分子杂交/ 158

6.3.1Southern印迹杂交/ 159

6.3.2Northern印迹杂交/ 164

6.3.3蛋白质印迹分析/ 167

6.4PCR扩增鉴定筛选/ 168

6.5DNA序列测定/ 169

6.5.1Sanger双脱氧末端终止法/ 169

6.5.2化学降解法/ 171

6.5.3自动测序法/ 172

6.5.4二代测序技术/ 173

6.5.5三代测序技术/ 176

6.5.6单细胞测序技术/ 179

6.5.7高通量测序在组学研究中的应用/ 180

本章小结/ 184

复习题/ 184

7基因工程在基因功能研究中的应用/185

7.1基因的表达谱研究技术/ 185

7.1.1胚胎原位杂交技术/ 186

7.1.2胚胎抗体染色技术/ 190

7.1.3基因芯片技术/ 194

7.2基因的突变研究技术/ 199

7.2.1化学诱变/ 199

7.2.2转座子全基因组诱变/ 200

7.3基因敲除技术/ 204

7.3.1完全基因敲除技术/ 204

7.3.2条件基因敲除技术/ 209

7.4基因编辑技术/ 214

7.4.1锌指核酶基因敲除技术/ 215

7.4.2TALEN基因编辑技术/ 218

7.4.3CRISPR基因编辑技术/ 221

7.5基因敲减技术/ 241

7.5.1RNA干扰技术/ 241