医学电镜技术及应用

第一篇 电镜及电镜技术 1

第一章 绪论 3

第二章 电镜的类型、基本构造及原理 9

第三章 常规透射电镜样品制备技术 18

第四章 特殊透射电镜样品制备技术 29

第五章 扫描电镜的生物样品制备技术 42

第二篇 细胞超微结构与超微病理 53

第六章 质膜及其特化物的超微结构与超微病理 55

第七章 细胞核的超微结构与超微病理 66

第八章 核糖体的超微结构与超微病理 76

第九章 内质网的超微结构与超微病理 79

第十章 高尔基复合体的超微结构与超微病理 86

第十一章 线粒体的超微结构与超微病理 91

第十二章 溶酶体的超微结构与超微病理 99

第十三章 微体的超微结构与超微病理 106

第十四章 细胞骨架的超微结构与超微病理 108

第十五章 中心粒、纤毛、鞭毛的超微结构与超微病理 114

第十六章 包涵体 118

第三篇 组织超微结构与超微病理 121

第十七章 血液系统的超微结构与超微病理 123

第十八章 心血管系统的超微结构与超微病理 134

第十九章 肝、胃、肠、胰的超微结构与超微病理 140

第二十章 呼吸系统的超微结构与超微病理 150

第二十一章 肾的超微结构与超微病理 155

第二十二章 内分泌系统的超微结构 163

第二十三章 神经组织的超微结构与超微病理 170

附：电镜技术在神经系统体视学研究中的应用 174

参考文献 180

附录1 专业名词英汉对照 183

附录2 常用试剂配方 195

第一篇　电镜及电镜技术

 第一章　绪论

 电子显微镜（electron microscope，EM，简称电镜）是研究细胞和组织超微结构及其功能的一种重要工具，在生物医学领域有广泛的应用。超微结构一般是指在光学显微镜（简称光镜）下不能分辨的组织、细胞细微形态结构（亚显微结构）和一些生物大分子的结构。对于解剖学、组织学、胚胎学、细胞学、病理学、法医学、病原生物学等基础医学形态学学科，电镜是常使用的形态学研究工具。机能学科如分子生物学、生理学、生物化学、病理生理学、药理学等，也可利用电镜这种形态学工具来探讨结构和功能之间的关系。

 人类是从宏观到微观不断深入和完善对机体的认识的。人眼的分辨能力大约是0.2mm，如果两点太靠近，成像在视网膜上就连成一个点而无法分辨。因此，人眼分辨不出只有几个微米大小的细胞。光镜的发明，让人类认识了细胞并分辨和推测出部分细胞器，但受光的波动性限制，光镜的分辨率为0.2μm。细胞学说是19世纪昀重大的自然科学发现之一。

 电镜的发明，突破了光镜受光波的衍射效应所限制的分辨极限，使许多在光镜下争论不休的问题得到了明确的回答，更使人们对微观结构的认识发生了一次新的飞跃。目前透射电镜的分辨率已经达到1.5～2.，几乎能分辨所有的原子。在常规电镜的基础上，科研人员研究出各种各样的方法，对细胞及其内部结构的形态和功能不断进行探索。尽管科学技术手段和研究方法在不断进步，但电镜高分辨率、直观的特点是其他手段和方法所不能替代的，因此电镜仍将是现代科学研究不可缺少的工具。

 一、电镜技术发展简史

 1932年，德国人Knoll和Ruska在电子光学理论发展的基础上，发明了世界上**台透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM，简称透射电镜），虽然其放大倍数仅12倍，却证明了以电子束和电子透镜组成的电子光学系统可以像光镜一样将物体放大成像。1934年，他们把电镜的分辨率提高到50nm，放大倍数达到了1万倍。这就是电镜的初型设计阶段。1939年，德国西门子公司生产了世界上**批作为商品的透射电镜，其分辨率优于10nm，放大倍数可达10万倍。此后，透射电镜逐渐改进设计，使分辨率不断得到提高。

 20世纪60年代，透射电镜的分辨率达到了0.5nm。70年代末电镜的分辨率已优于0.3nm，晶格条纹分辨率达到了0.14nm，实现了人们早就向往的对原子像和晶格像的观察。 20世纪80年代，电镜已经发展成一种综合分析仪器，在高分辨率透射电镜的主体上，可以安装景深长、便于制备样品、分辨率优于5nm的扫描透射型附件，还可以安装配有计算机系统的能量分析谱仪，从而对样品进行元素的成分分析，使透射电镜既能观察样品的形态，又能分析样品的成分。

 1942年，剑桥大学的D. M. Mullan在C. Wcatly的指导下，*次制成世界上**台扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM，简称扫描电镜）。由于当时电子技术落后，这台电镜分辨率只能达到1μm，比光镜还要低，拍摄一幅图像需要的曝光时间长达几小时。因此，**台扫描电镜未引起普遍重视，致使扫描电镜的发展受到了极大影响，直至1965年扫描电镜才基本定型。由于扫描电镜具有使用范围广、分辨率高、图像立体感强、放大倍率选择范围广、样品制备方便等优点，使其后期发展速度比透射电镜要快得多。目前，扫描电镜还可装X光谱仪、电视及用微机控制的图像处理仪附件。

 我国电镜的研制在1958年以前还是空白。1959年，中国科学院光学精密机械研究所、上海精密医疗器械厂、中国科学院电子学研究所等单位共同研制了我国**台透射电镜，型号为DX-100，但其分辨率、放大倍数都比较低。经过多年的努力，1977年中国科学院北京科仪厂设计制造出了高分辨率的透射电镜，点分辨率可达到0.3nm，晶格条纹分辨率可达到2nm，放大倍数可达到80万倍。

 20世纪60年代初，我国就有一些大学、研究所进行了扫描电镜的理论研究和仪器试制工作。经过努力，中国科学院北京科仪厂试制成功了我国**台DX-3型扫描电镜。目前我国已能够生产高分辨率、多功能的扫描电镜。

 二、电镜与光镜的比较

 为了便于读者理解电镜的构成和成像过程，现将电镜与光镜做一比较：电镜的总体结构、成像原理、操作方式等均与光镜有着本质上的区别，但它们的显微放大过程基本相似，都是由光学系统、成像系统和放大系统完成（表1-1）。

 表1-1　电镜与光镜的比较

 光镜一般采用可见光作为光源，采用玻璃透镜作为成像、放大透镜。其成像过程：可见光通过空气和玻璃透镜这两种不同的物质界面时，光的运动速度发生改变，从而运动方向发生改变，使之汇聚于一点（焦点），然后再发散，这样就可以把物体的细节加以放大成像，使人们观察到物体的结构。

 电镜采用电子束作为光源，采用电磁透镜作为成像、放大透镜，其基本成像过程：电子束通过电磁透镜时，由于电磁场的作用，电子改变其运动方向而汇聚在一点（焦点），然后发散，从而把物体的微细结构放大成像。不过此时的成像，人眼不能直接观察到，还须通过一个荧光屏才能看到。此外，电磁透镜有一个基本的不同于光学玻璃透镜的特点，即电子束离开它原来运动轨迹发生弯*或者折射是由于外力对电子的作用，在磁场中始终有一个分力作用在电子上，所以折射是连续的，并且在折射介质（磁场）和浸入介质（真空）之间没有明显的界面，而光镜对光线的折射是产生在透镜和它的浸入介质之间的分界面上。

 三、分辨率与形态研究的关系

 人类总是希望能更加深入地了解周围世界的物体，特别是细节，随着放大镜的使用，人类可以将物体进行放大，观察物体的细节。例如，用10倍的放大镜可以将两点间的距离放大10倍，肉眼就可以分辨0.02mm之间的两点，因此可以将物体看得更清晰，但单个放大镜的倍数毕竟有限，不能达到更高的分辨率。

 随着社会的发展，人类学会了将多个放大镜组合使用，这就形成了光镜。光镜的光学部件主要包括物镜和目镜，其放大倍数为物镜放大倍数和目镜放大倍数的乘积。光镜的发明和使用，推动了组织学、细胞学、病理学等相关学科的发展，也促使人类对自然界的认识由宏观世界进入了微观世界。

 光镜的问世，对生物学、医学的发展有很大的推进作用。遗憾的是，由于光波特性的限制，光镜的分辨率也有一定的限制，光镜只能观察到0.2μm的结构，对细胞内和细胞间许多细微结构的观察则无能为力。

 分辨率或称分辨能力，代表能将邻近两点清晰区分辨认的能力，用能被辨认的邻近两点的距离表示。能被辨认的两点距离越小，表示分辨能力越大。人眼的分辨能力与观察物体时的环境照明有关，也与物体和背景间黑白对比度有关，这就引入另一重要概念“反差”。反差高时，容易从背景上辨认物体；反差低时，就不易把物体从背景上分辨出来。物体在人眼视网膜上成像的大小和物体与人眼之间距离的关系：物体与眼睛的距离缩小，视网膜上的物像就增大，眼睛的分辨率就提高。但由于眼屈光能力的限制，物体移近眼睛的距离是有限度的，一般将眼睛正常的工作距离定为25cm并称为“明视距离”。当物体离眼睛25cm时，眼睛可分辨出相距0.2mm的两个点，因此将0.2mm定为人眼的分辨率。

 为提高人眼的分辨能力，可设法将物体放大。光镜放大物体时，由于可见光波的平均波长为400nm，当物体两点间距离小于光波的半个波长（200nm）时，光波发生衍射现象，使两点不能被辨认。因此，光镜可以辨认的两点间昀小距离是200nm。这就是光镜的极限分辨率，比人眼分辨率（0.2mm）提高了1000倍。为了进一步提高分辨率，人们选择了波长较短的电子射线作“光源”，制造了电镜。电子射线的波长可随加速电压的增加而进一步变短。但由于电镜存在球差，限制了其分辨率不能真正达到电子射线波长之半的程度。目前较好的电镜的分辨率为0.2nm左右，比一般光镜的极限分辨率（200nm）提高了1000倍，比人眼分辨率（0.2mm）高100万倍。

 电镜本身的分辨率虽可达0.2nm左右，但观察物体时的实际分辨率还受到诸多因素如切片厚度等的影响。切片较薄时，电镜分辨率为1～2.5nm；切片较厚时，实际分辨率为5～ 10nm。在生物科学和医学研究中，采用肉眼、光镜和电镜观察时，它们的分辨率不同，适用范围也不同。小于0.1mm、大于1μm的结构，如细胞、细胞核和其他一些大的细胞器，主要在光镜下观察；小于1μm、大于数纳米的结构，如亚细胞成分、细菌、病毒和大分子等，主要用电镜观察。

 目前，我们将介于细胞水平和大分子水平之间的结构称为亚显微镜结构（submicroscopic structure），简称亚微结构或亚细胞结构（subcellular structure），也称细微结构（fine structure）。超微结构（ultrastructure），严格地讲是指分子水平的结构。但目前一般所称的亚微结构、亚细胞结构、细微结构和超微结构并无严格的界限，通常将普通光镜分辨界限以下的结构统称为超微结构。

 四、细胞超微结构研究展望

 随着观察方法和手段的不断提高，人类对超微结构的研究和认识也在不断地发展，主要体现在以下几个方面。

 1.从二维结构向三维结构发展从研究平面结构向研究立体结构方向发展，其中包括超高压电镜及倾斜标本台的应用；连续超薄切片的制备及三维重建技术的应用；冷冻蚀刻技术和扫描电镜技术的应用等。这使细胞核和染色体结构的研究、细胞内管道系统的立体研究、细胞膜（包括细胞内膜）表面结构的研究和细胞邻界面上连接结构的研究等获得了很多新的进展。

 2.从单纯形态观察深入到对其功能、代谢、化学组成、分子结构及元素分布的研究包括冷冻超薄切片、电镜免疫标记、电镜酶细胞化学、电镜放射自显影、电子探针X线显微分析及扫描隧道-原子力显微术等技术的应用。

 3.从定性描述向定量测定的方向发展自动计数装置和电子计算机技术的应用，使电镜形态测量技术（electron microscopy morphometry measurement technology）和电子探针X线显微分析技术也都获得了相应的发展，使研究结果能够被量化，并且更为精确。

 4.从观察经过化学固定的结构向直接观察活细胞整体方向发展超高压电镜、超真空技术进一步发展，特殊样品室设计和改进，扫描隧道显微术的应用等，为在显微镜下直接观察处于生理条件下的样品创造了可能。

 5.仪器设备向小型化、计算机控制的数字化方向发展

 五、电镜技术在生物医学中的应用

 电镜的问世为人类探索微观世界的奥秘开辟了新纪元。半个多世纪以来，电镜技术的飞速发展、制样技术的不断创新，使其应用范围越来越广泛，涉及工业、国防、航空、地质、农业、医学生物学等多个领域。

 ……

本书主要分为3篇: 第一篇, 电镜及电镜技术。介绍了常用电镜的类型、简单的成像原理和观察方法, 以及常用的阳平制备技术等内容。第二篇, 细胞超微结构和超微病理, 对细胞膜、细胞核、线粒体、内质网、高尔基复合体、溶酶体、微体、细胞骨架等的超微结构和超微病理变化进行了介绍。第三篇, 组织的超微结构和超微病理, 对造血系统、心血管系统、消化系统、呼吸系统、肾、内分泌系统和神经系统等常见的超微结构和超微病理进行了介绍。在编写过程中, 全体编委总结了本实验室多年电镜技术服务过程中所获得的经验, 也学习了国内外的多种先进技术和理念, 期望能够对相关科研人员提供相关的信息。第二版在第一版基础上增加了部分新内容, 并对原来的内容进行了更新。