细胞生物学实验教程

目录

第一篇　基础性实验

第一章　光学显微镜及其制片技术　2

实验一　普通光学显微镜的使用与显微测量　2

实验二　特殊光学显微镜的原理及使用　10

实验三　显微制片技术　24

实验四　显微摄影技术　34

第二章　电子显微镜及其制样技术　39

实验五　透射电子显微镜原理及样品制备　39

实验六　扫描电子显微镜原理及样品制备　50

实验七　免疫电镜技术　54

第三章　细胞的形态结构观察　58

实验八　细胞的显微观察　58

实验九　DNA的细胞化学反应—Feulgen反应　64

实验十　RNA的细胞化学—Brachet反应　66

实验十一　DNA原位杂交　68

实验十二　细胞中多糖的定位　70

实验十三　细胞中酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和过氧化物酶的定位　73

实验十四　细胞器的活体染色与观察　77

实验十五　细胞器的分离纯化与鉴定　83

实验十六　细胞器间的相互作用关系　87

实验十七　细胞骨架的染色与观察　91

第四章　细胞生理　98

实验十八　细胞膜的通透性　98

实验十九　细胞膜电生理　100

实验二十　线粒体跨膜电位检测　104

实验二十一　细胞的凝集反应　107

实验二十二　小鼠巨噬细胞吞噬功能检测　109

实验二十三　活性氧的检测　111

第五章　细胞分裂与染色体标本制备　114

实验二十四　植物细胞有丝分裂观察及染色体标本制备　114

实验二十五　动物细胞有丝分裂观察与染色体标本制备　116

实验二十六　动植物细胞减数分裂观察与染色体标本制备　119

实验二十七　人类染色体标本制备和核型分析　123

实验二十八　动植物染色体G显带技术及带型分析　126

第二篇　综合性实验

第六章　细胞工程技术　130

实验二十九　动物细胞培养　130

实验三十　单克隆抗体的制备　136

实验三十一　哺乳动物细胞的转染　140

实验三十二　小鼠胚胎干细胞培养与体外诱导分化　142

实验三十三　植物原生质体制备与外源基因的瞬时表达　145

第七章　细胞周期　148

实验三十四　流式细胞术检测细胞周期中DNA的含量　148

实验三十五　细胞周期同步化　150

第八章　细胞衰老与死亡　152

实验三十六　细胞衰老的诱导及检测　152

实验三十七　细胞生死状态的鉴别　154

实验三十八　细胞凋亡的生化特征检测　157

实验三十九　细胞自噬的检测　160

第三篇　设计性实验

第九章　细胞对不同因素的响应　166

实验四十　免疫检查点抑制剂对肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移能力的影响　166

实验四十一　药物对巨噬细胞RAW264.7免疫活性的影响　168

实验四十二　药物对H2O2诱导小鼠胰腺腺泡细胞损伤的影响　171

实验四十三　诱变剂、污染物等对染色体的损伤效应　174

附录1　细胞生物学实验室安全注意事项　177

附录2　细胞生物学实验报告　178

附录3　常用缓冲液配制　179

附录4　常用培养基配制　182

数字资源

实验一　普通光学显微镜的使用与显微测量

实验二　特殊光学显微镜的原理及使用

实验三　显微制片技术

实验十四　细胞器的活体染色与观察

实验十八　细胞膜的通透性

实验二十一　细胞的凝集反应

实验二十二　小鼠巨噬细胞吞噬功能检测

实验二十四　植物细胞有丝分裂观察及染色体标本制备

实验二十五　动物细胞有丝分裂观察与染色体标本制备

第一篇基础性实验

 第一章光学显微镜及其制片技术

 实验一普通光学显微镜的使用与显微测量

 【实验目的】

 1.熟悉普通光学显微镜的主要构造及其性能。

 2.熟练掌握光学显微镜的使用方法。

 3.掌握显微测量的方法

 【实验原理】

 一、普通光学显微镜的成像原理

 现代普通光学显微镜（optical microscope）利用凸透镜成像原理获得所观察样品的放大影像。其核心成像部件为两组凸透镜（物镜、目镜），成像原理如图1-1所示。

 图1-1光学显微镜成像原理

 将标本置于物镜一侧1～2倍焦距之间，通过物镜可在其另一侧成一反方向放大实像，放大倍数为物镜放大倍数，此实像位于目镜焦距之内，人眼通过目镜观察此放大实像，可看到一个和标本成反方向的放大虚像，总放大倍数是物镜和目镜放大倍数的乘积。

 二、普通光学显微镜的主要结构

 普通光学显微镜结构见图1-2，一般包括机械部分、光学放大部分和照明部分。

 1.机械部分

 （1）镜座：显微镜底座，支撑整个镜体。

 （2）镜柱：镜座上面直立部分，连接镜座和镜臂。

 （3）镜臂：连接镜筒和镜柱的弯曲构造，是取放显微镜的手握部位。

 （4）镜筒：镜筒上端连接目镜，下端连接物镜转换器。现代光学显微镜的镜筒为倾斜式双目镜筒，目镜端倾斜45°，利于观察。双目镜筒设计时为适应不同人的瞳距，添加调节两目镜间距离装置，称瞳距调节器。为了补偿两眼的屈光度差别，至少一个目镜基座上带有屈光度调节旋钮。带有摄影功能的显微镜的镜筒为三目镜筒，其中一目通向摄影装置。镜筒内有复杂的折光和分光棱镜，确保光线可弯折并分配到指定的目镜。三目镜筒一般会有分光棱镜拉杆，拉到不同位置时，光线会分配到不同的目镜。

 （5）物镜转换器：镜筒下方可左右自由旋转的圆盘，上有多个安装物镜的圆孔，用以安装不同的物镜。转动物镜转换器，当听到叩碰声时正下方的物镜恰好对准通光孔。

 （6）载物台：物镜转换器下方的平台，可放置玻片标本。载物台上有标本夹以固定标本，通常会装有标本移动器，旋转标本移动器的两个旋钮可使标本夹前后或左右移动，利于快速并准确寻找目标。载物台中央开孔，称为通光孔，来自下方的照明光经此孔照射上来。

 （7）调焦旋钮：依调焦方法的不同，显微镜可分为镜筒移动型和载物台移动型两种，现代显微镜一般为载物台移动型，其调焦旋钮在镜柱下端，顺时针或逆时针旋转调焦旋钮可使载物台上下移动。调焦旋钮有粗调焦旋钮和细调焦旋钮两种，粗调焦旋钮用于低倍镜观察时快速移动载物台，细调焦旋钮用于高倍镜观察时精细调焦。

 部分种类的显微镜的粗调焦旋钮和细调焦旋钮同轴，粗调焦旋钮靠近镜柱。调焦装置有预调焦限位开关，用于限定粗调焦旋钮调节载物台上升时的*高位置。一般将此位置设定为稍高于聚焦位置，这样可快速转动粗调焦旋钮上升到此处，再缓慢下降，即可快速到达调焦位置。

 2.光学放大部分

 （1）物镜：安装在物镜转换器上，是显微镜*主要的光学部件。物镜常用的放大倍数有4×、10×、40×、100×等。一般称40×及以上倍数为高倍镜，有些倍数较高的高倍镜在使用时要在镜头前端和标本间充满高折射率的油，此种物镜称油浸物镜，简称油镜。

 在聚焦情况下，物镜前端和样品间的距离称工作距离（working distance），物镜后端定位面和样品间的距离称齐焦距离（parfocal distance）。物镜放大倍数越大，焦距越短，工作距离越短。接在一个显微镜上的不同物镜，其齐焦距离*好相同，聚焦后，换另一物镜观察时，仅通过细调焦旋钮微调即可聚焦。图1-3显示了不同放大倍数的物镜的工作距离、齐焦距离以及表面标识的性能参数，其中*重要的参数是数值孔径，其数值决定了所观察图像的分辨率。油镜上会有“油”“Oil”等标识。

 图1-3物镜的主要性能参数及工作距离、齐焦距离

 （2）目镜：安装在镜筒的上端，放大倍数为5×、10×、15×等。常用的为10×。在目镜内，有一金属环，其大小决定了视野的*大范围。在物镜聚焦的状态下，样品通过物镜所成放大实像正好位于金属环处，如果在此放置一个带有等间距刻度线的透明玻璃片（目镜测微尺），能同时看清刻度线和样品像，从而可对样品像进行相对测量。

 3.照明部分

 照明部分主要包括光源和照明光路两部分，现代显微镜大都采用电光源照明。照明光路有临界照明、散射光照明和科勒照明3种（图1-4）。

 图1-43种照明方式光路简图

 （1）临界照明：此种照明光路系统包括凸透镜、聚光器（含聚光器透镜和聚光器光阑），调整聚光器高度，使灯丝通过凸透镜和聚光器透镜成像于载玻片的样品处，这样可提高样品处的光亮度。早期的电光源亮度低，为了提高照明亮度，显微镜多采用临界照明方式，但是临界照明方式的缺点是照明不均匀，样品处温度较高。

 （2）科勒照明：此种照明光路系统包括凸透镜（多组）、光源视场光阑、聚光器。调整聚光器高度，使光源视场光阑经聚光器透镜成像于载玻片的样品处，此时灯丝像成像于聚光器光阑处，这样可使样品处的照明均匀，亮度较高且不至于温度过高。调节光源视场光阑和聚光器对中旋钮，使其在载玻片处的像正好外切目镜的观察视野。科勒照明方式大多用于对性能要求较高的研究级显微镜中。

 （3）散射光照明：此种照明光路系统包括毛玻璃、聚光器。由光源发出的光经毛玻璃变为散射光，散射光经聚光器会聚后再照射到样品上，照明均匀，但是亮度较科勒照明低一些，一些对性能要求较低的教学级别显微镜采取了此种照明方式。

 照明光路中的聚光器：以上3种照明方式的照明光路中，均采用了聚光器，其位于载物台的通光孔下方，由聚光器透镜和聚光器光阑组成。在散射光照明方式中聚光器的高度越高，照明范围越小，亮度越低。而临界照明和科勒照明方式中聚光器高度必须调整到特定位置。聚光器光阑的大小主要影响成像的分辨率、对比度和景深范围，*好不要用其来调节照明亮度。

 三、显微镜使用中的一些重要参数及术语

 1.数值孔径和分辨率

 数值孔径（numerical aperture，NA）是物镜和聚光器的重要参数，其值为nsinθ，其中n为透镜要求介质的折射率，大部分透镜要求介质为空气，折射率为1，油镜所需介质物镜油的折射率在1.5左右。θ为聚焦时透镜边缘到样品视野中央点的夹角一半（图1-3）。一个物镜一旦制作完成，其数值孔径就是一个固定值，一般会标识在其放大倍数之后。

 具有可变光阑的聚光器的数值孔径随光阑开口大小变化而变，可变光阑开口越大，θ越大，数值孔径值越大。多数可变光阑聚光器上标有数值孔径值刻度或物镜的放大倍数标识，用以指示光阑开口大小。