滑膜调节交叉韧带修复的力学生物学机制研究

张艳君，生物医学工程学博士，硕士生导师，现为太原理工大学生物医学工程学院教师。主持国家自然科学基金和省级基金3项，校级教改项目1项，发表论文10余篇，授权国家发明2项，长期从事组织修复过程中的力学生物学调控机制及再生医学材料研究。

第1章 绪论

 1.1 问题的提出与研究意义

 1.1.1 问题的提出

 1.1.2 研究意义

 1.2 国内外研究现状

 1.2.1 交叉韧带的结构及功能

 1.2.2 交叉韧带损伤机理

 1.2.3 赖氨酰氧化酶的结构、作用及与骨科疾病的关系

 1.2.4 基质金属蛋白酶的结构、作用及与骨科疾病的关系

 1.2.5 滑膜在膝关节活动中的重要性

 1.2.6 基底形变加载技术的发展

 1.3 研究目的和研究内容

 1.3.1 研究目的

 1.3.2 研究内容

第2章 机械拉伸对膝关节滑膜细胞中LoXs和MMP-1、MMP-2、MMP一3基因表达的影响

 2.1 引言

 2.2 实验材料、仪器与试剂

 2.2.1 实验材料

 2.2.2 实验仪器

 2.2.3 实验试剂

 2.2.4 实验试剂的配制

 2.3 实验方法

 2.3.1 细胞培养

 2.3.2 细胞力学拉伸加载装置的准备

 2.3.3 细胞接种

 2.3.4 Real-Time PCR

 2.3.5 统计学处理

 2.4 实验结果

 2.5 分析与讨论

 2.6 本章小结

第3章 TNF-α和IL-1β对滑膜成纤维细胞中LOXs和MMP-1、MMP-2、MMP基因表达的影响

 3.1 引言

 3.2 实验材料、仪器与试剂

 3.2.1 实验材料

 3.2.2 实验仪器

 3.2.3 实验试剂

 3.2.4 实验试剂的配制

 3.3 实验方法

 3.3.1 细胞培养

 3.3.2 炎症因子处理

 3.3.3 Real一Time PCR

 3.3.4 明胶酶谱

 3.3.5 统计学处理

 3.4 实验结果

 3.4.1 不同浓度TNF-α对滑膜成纤维细胞中LOXs和MMPs(MMP-1、MMP-2、MMP-3)基因表达的影响

 3.4.2 不同浓度IL—lB对滑膜成纤维细胞中L()Xs和MMPs(MMP-l、MMP一2、MMP-3)基因表达的影响

 3.4.3 TNF一仅和IL-1β对滑膜成纤维细胞中LOXs和MMPs(MMP-1、MMP-2、MMP-3)基因表达的影响

 3.4.4 TNF-α和IL-1β对滑膜成纤维细胞中MMP一2活性的影响

 3.5 分析与讨论

 3.6 本章小结

第4章 损伤性力学拉伸和TNF-α对滑膜成纤维细胞中LOXs和MMP-1、MMP-2、MMP-3基因表达的影响

 4.1 引言

 4.2 实验材料、仪器与试剂

 4.2.1 实验材料

 4.2.2 实验仪器

 4.2.3 实验试剂

 4.3 实验方法

 4.3.1 细胞培养

 4.3.2 炎症因子处理

 4.3.3 力学因子加载及炎症因子刺激

 4.3.4 滑膜细胞划痕实验

 4.3.5 Real—rrime PCR

 4.3.6 明胶酶谱

 4.3.7 统计学处理

 4.4 实验结果

 4.4.1 5n/mL TNF-α对滑膜成纤维细胞中L0xs和MMPs基因表达的影响

 4.4.2 损伤性力学拉伸(12％)与TNF-α对滑膜成纤维细胞中L0xs和MMPs(MMP-1、MMP-2、MMP-3)基因表达的影响

 4.4.3 损伤性力学拉伸(12％)与TNF-α对滑膜成纤维细胞中MMP-2活性的影响

 4.4.4 5n/mL TNF-α对滑膜成纤维细胞迁移的影响

 4.5 分析与讨论

 4.6 本章小结

第5章 损伤性力学拉伸和TGF-β，对滑膜成纤维细胞中LoXs和MMP-1、MMP-2、MMP-3基因表达的影响

 5.1 引言

 5.2 实验材料、仪器与试剂

 5.2.1 实验材料

 5.2.2 实验仪器

 5.2.3 实验试剂

 5.3 实验方法

 5.3.1 细胞培养

 5.3.2 生长因子处理

 5.3.3 信号通路抑制剂处理

 5.3.4 Real.Time PCR

 5.3.5 统计学处理

 5.4 实验结果

 5.4.1 不同浓度TGF—β，对滑膜成纤维细胞中LOXs和MMPs(MMP-1、MMP-2、MMP-3)基因表达的影响

 5.4.2 TGF一β1对正常滑膜成纤维细胞中L0xs和MMPs(MMP-1、MMP-2、MMP-3)基因表达的影响

 5.4.3 TGF-β1对受损滑膜成纤维细胞中LOXs和MMPs(MMP-1、MMP-2、MMP-3)基因表达的影响

 5.4.4 NF-KB信号通路抑制剂对损伤性力学加载和TGF-β1诱导的MMP表达及活性的影响

 5.5 分析与讨论

 5.6 本章小结

第6章 共培养下后交叉韧带成纤维细胞中LOXs的基因表达情况

 6.1 引言

 6.2 实验材料、仪器与试剂

 6.2.1 实验材料

 6.2.2 实验仪器

 6.2.3 实验试剂

 6.2.4 实验试剂的配制

 6.3 实验方法

 6.3.1 细胞培养

 6.3.2 半定量聚合酶链式反应

 6.3.3 Real—Time PCR

 6.3.4 统计学处理

 6.4 实验结果

 6.4.1 与滑膜细胞共培养下，常规PcR反应出的LOXs基因家族在PcL成纤维细胞中的表达

 6.4.2 与滑膜细胞共培养下，定量PCR反应出的LOXs基因家族在PcL成纤维细胞中的表达

 6.5 分析与讨论

 6.6 本章小结

第7章 结论与展望

 7.1 主要结论

 7.1.1 力学加载对滑膜成纤维细胞中L0xs和MMPs表达的影响

 7.1.2 TNF-α和IL—lβ对滑膜成纤维细胞中LOXs和MMPs的表达及MMP-2活性的影响

 7.1.3 损伤性力学加载和TNF-α对滑膜成纤维细胞中LOXs和MMPs的表达及MMP-2活性的影响

 7.1.4 损伤性力学加载和TGF-β，对滑膜成纤维细胞中LOXs和MMPs的表达及MMP-2活性的影响

 7.1.5 NF-KB信号通路参与力学加载和TGF-β1对MMP-2活性的调节过程

第1章绪论

1.1问题的提出与研究意义

1.1.1问题的提出

膝关节为人体最大且构造最复杂的关节,其中前交叉韧带（anterior cruciate ligament,ACL）与后交叉韧带（posterior cruciate ligament,PCL）位于膝关节腔内，彼此相互交叉，是保证膝关节正常运动功能的重要稳定结构，如图1.1所示。两条完好的交叉韧带共同承受的能力比两条韧带分别承受能力的和还要高50%左右，说明前、后两交叉韧带的有机配合，使韧带在整体上发挥了最优力学状态。一旦其中一条韧带受损，膝关节的稳定性以及功能发挥都会大大减弱[。近些年来，随着人们对运动活动重视程度的增加，膝关节损伤的发生率也在逐年提高，尤其是膝关节韧带损伤已成为运动损伤中最为普遍的膝关节损伤。2003年美国骨科医学委员会（ABOS）的数据统计显示，膝关节韧带重建手术一跃占据外科手术第六位，且每年大概有十万病人因韧带损伤而导致残疾[2]。由于ACL与PCL损伤后无法像内侧副韧带（medial collateral ligament,MCL）一样进行自我功能性修复而引起医学界以及科学界的重大关注。

面对这一难题，目前最好的解决办法就是通过自体移植、异体移植和人工合成材料进行韧带重建手术。虽然自体或者异体移植物重建交叉韧带是目前外科手术的主流选择，如自体髌肌腱移植物能保证较高的力学强度，但自体供区会引发髌腱炎、腘绳肌缺失、髌下脂肪垫挛缩、相应部位髌骨骨折等并发症。异体跟腱、腘绳肌腱以及胫前或胫后肌腱有传染疾病的危险，还可能存在供体来源受限、免疫排斥及愈合延迟等问题，且价格相对比较昂贵。与自体和异体移植相比，人工合成材料虽然具有不损伤自体组织、手术操作简单、材料来源可靠可控等优点，然而远期随访发现由于韧带降解、变性和组织相容性差等原因，使其松弛、断裂并导致关节内渗出和滑膜炎等并发症，严重影响手术效果[35]。

当前关于交叉韧带损伤的研究主要集中在重建手术，而对其损伤与修复机理的研究甚少。因此，从受损交叉韧带的愈合机理入手探讨其无法愈合的原因，从而有针对性地做出调控，是一种不需要外科手术就可以使损伤的交叉韧带自我功能性修复的好方法。

研究者在研究韧带损伤与修复过程中发现交叉韧带无法愈合与细胞的迁移、增殖以及细胞外基质合成有关（68）。此外细胞外基质合成与降解平衡与否也关系到韧带的修复能力。参与这一平衡调节过程的有三种酶：基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）、基质金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMPs）和赖氨酰氧化酶（lysyl oxidases,LOXs）。MMPs是一组高度保守的依赖于锌离子蛋白质水解酶家族，几乎能降解细胞外基质的所有成分。TIMPs是MMPs的主要生理性抑制剂，是一组能够抑制MMPs活性的蛋白质家族[9]。LOXs是一组依赖于铜离子的胺氧化酶，它能够催化胶原和弹性纤维中赖氨酸残基使其脱氨转变为醛基，不稳定的醛基之间进行缩合反应，使胶原和弹性蛋白分子发生交叉连接，从而生成成熟稳定的细胞外基质[0-1]。胶原分子中每增加0.1个席夫碱样的交叉连接，胶原对胶原酶的抵抗力就会增加2～3倍[12]。Wang等15指出ACL成纤维细胞中MMP-2/TIMP-1和MMP-2/TIMP-2呈增高的趋势，也就是说在组织降解过程中MMPs起的降解作用远远大于TIMPs，所以在韧带愈合过程中，细胞外基质降解与合成的平衡的调节主要是由MMPs和LOXs来完成的。近几年研究发现：相对于MCL成纤维细胞，力学因子与化学因子刺激下的ACL成纤维细胞中LOXs的低表达以及MMPs的高表达破坏了受损ACL愈合过程中细胞外基质合成与降解的平衡，被认为是造成ACL无法自我修复的原因之一[1+7]动物实验发现，对交叉韧带产生降解作用的MMPs除了部分来自其自身，还有部分MMPs来自关节内其他组织（如PCL、滑膜组织、半月板和关节软骨），其中滑膜组织作用最显著，并提出了滑膜在关节腔内具有微环境调控作用[8]。为了进一步更深入地探讨滑膜的关节腔微环境调控作用，本研究主要从交叉韧带损伤以后关节腔内力学和化学因素的变化入手，在细胞水平上研究力学因子与细胞因子对滑膜成纤维细胞中LOXs