医学细胞生物学与遗传学实验

目录

第一篇医学细胞生物学实验

实验一光学显微镜的构造和使用方法　1

实验二细胞的显微测量技术　6

实验三细胞器的光镜观察　7

实验四细胞骨架的观察　9

实验五细胞内化学成分（糖原、蛋白质及核酸）的显示　11

实验六细胞组分的分级分离　14

实验七细胞生理活动的观察　16

实验八细胞融合　18

实验九体外培养细胞的计数、测量与活性鉴别　21

实验十细胞有丝分裂的制片及观察　26

实验十一细胞减数分裂的制片及观察　28

实验十二细胞的原代培养　31

实验十三细胞的传代培养　32

实验十四培养细胞的冻存、复苏与运输　33

第二篇医学遗传学实验

实验一小鼠骨髓细胞染色体标本制备与分析　37

实验二人类外周血淋巴细胞培养及染色体制备与分析　38

实验三人类体细胞染色体的核型分析　41

实验四正常人体细胞G显带染色体制备与观察　41

实验五人类体细胞G显带染色体的核型分析　43

实验六人类外周血淋巴细胞姐妹染色单体互换标本的制备与分析　44

实验七银染核仁形成区与近端着丝粒染色体随体联合　45

实验八人类性染色质的制片与观察　46

实验九动物细胞微核测定技术　48

实验十皮纹分析与PTC尝味　49

实验十一遗传咨询　53

实验十二人类基因组DNA的提取　55

实验十三　DNA限制性内切酶酶解及酶解片段的电泳分离　56

实验十四　DNA分子杂交　58

实验十五荧光原位杂交技术　59

实验十六Y染色体短串联重复序列的多态性分析　60

实验十七表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析　63

第三篇医学细胞生物学学习指导

第一章绪论　66

第二章细胞的分子基础和基本特征　71

第三章细胞膜及其表面　79

第四章物质的跨膜运输　92

第五章细胞质基质与内膜系统　100

第六章线粒体　109

第七章细胞骨架　117

第八章核糖体　127

第九章细胞核　132

第十章细胞信号转导　143

第十一章细胞分裂与细胞周期　149

第十二章细胞分化与干细胞　160

第十三章细胞衰老和死亡　170

第十四章细胞生物学的研究方法　179

第四篇医学遗传学学习指导

第一章遗传学与医学　187

第二章单基因病的遗传　191

第三章多基因遗传病　199

第四章染色体病　204

第五章群体遗传学　213

第六章单基因遗传病　218

第七章线粒体遗传病　223

第八章出生缺陷　230

第九章肿瘤与遗传　236

第十章表观遗传学　244

第十一章遗传病的诊断、治疗与遗传咨询　249

附录一实验室规则　257

附录二医学细胞学与遗传学实验报告的书写　258

附录三医学细胞学与遗传学实验报告　259

第一篇 医学细胞生物学实验

实验一 光学显微镜的构造和使用方法

【实验目的】

(1)掌握低倍镜、高倍镜和油镜的使用方法。

(2)熟悉光学显微镜各部件的构造和用途。

(3)了解显微镜维护的基本知识。

【实验材料】

(1)器材：光学显微镜、载玻片、擦镜纸、香柏油、二甲苯等。

(2)材料：蛙血涂片、兔脊神经节切片等。

【实验方法】

(一)光学显微镜的构造

光学显微镜是一种复杂的光学仪器。它是医学实验常用工具之一，其作用是将观察的标本放大，以便观察和分析。

1. 机械装置

(1)镜座：位于最底部的构造，用以支持着整个镜体，起稳固作用。

(2)镜柱：是垂直于镜座上的短柱，用以支持镜臂。

(3)镜臂：是支持镜筒和载物台的呈弓形结构的部分，是取用显微镜时持握的部分。

(4)调节器：也称调焦螺旋，是调节焦距的装置，分粗调节器和细调节器两种。粗调节器可使镜筒或载物台较快或较大幅度的升降，适于低倍镜观察时调焦。细调节器可使镜筒或载物台缓慢或较小幅度地升降，适用于高倍镜和油镜下进行焦距的精细调节。

(5)镜筒：位于镜臂的前方，它的上端装载目镜，下端连接物镜转换器。根据镜筒的数目，光镜可分为单筒式和双筒式。目前常用的光镜为双筒式，其镜筒均为倾斜式的。

(6)物镜转换器：又称旋转盘，位于镜筒下端的一个可旋转的凹形圆盘上，一般装有2～4个放大倍数不同的物镜。旋转它就可以转换物镜。旋转盘边缘有一定卡，当旋至物镜和镜筒呈直线时，就发出“咔”的响声，这时才可观察玻片标本。

(7)载物台：又称镜台，是位于镜臂下面的平台，用以放置玻片标本。载物台中央有一圆形的通光孔，光线可以通过它由下向上反射。

(8)标本推进器：位于载物台的后方或侧面边缘，连接一个可移动弧形弹簧夹。其上方或下方一侧有两个旋钮，转动旋钮可调节推进器，使玻片标本前后或左右移动。 标本推进器上有纵横游标尺，用以测定标本在视野中的方位及其大小。

光学显微镜包括机械装置和光学系统两大部分，如图1-1 所示。

2. 光学系统

(1)反光镜：是装在载物台下面、镜柱前方的一面可转动的圆镜，它有平、凹两面。平面镜聚光力弱，适合光线较强时使用；凹面镜聚光力强，适于光线较弱时使用。转动反光镜，可将光源反射到聚光镜上，再经载物台中央通光孔照明标本。

图1-1 光学显微镜的构造

1.目镜；2.物镜转换器；3.物镜；4.标本夹；5. 载物台(中央为通光孔)；6.可变光阑；7.反光镜；8.镜座；9.镜筒；10.镜臂；11.镜柱；12.粗调节器；13.细调节器；14.标本推进器

(2)可变光阑：是在聚光镜底部的一个圆环状结构。它装有多片半月形的金属薄片，叠合在中央呈圆孔形。在圆环状结构的外缘有一突起的小柄，拨动它可使金属片分开或合拢，可以控制光线的强弱，使物像变得更清晰。

(3)聚光镜：在载物台下方，是一组透镜，用以聚集光线增强视野的亮度。调节旋钮在载物台下方旋钮，转动它可升降聚光镜。聚光镜上升时增强反射光，下降时减弱反射光。

(4)物镜：装在物镜转换器上，一般分低倍镜、高倍镜和油镜三种。低倍镜的镜体较短，放大倍数小；高倍镜的镜体较长，放大倍数较大；油镜的镜体最长，放大倍数最大(在镜体上刻有数字，低倍镜一般有4×、10×，高倍镜一般有40×、45×，油镜一般是90×、100×，×表示放大倍数)。

(5)目镜：装在镜筒上端，其上一般刻有放大倍数(如5×，10×)。目镜内常装有一指示针，用以指示要观察的某一部分。

显微镜放大倍数的计算：显微镜对实物的放大倍数=目镜放大倍数×物镜放大倍数。

(二)光学显微镜的使用方法

1. 低倍镜的使用

(1)对光：转动物镜转换器，使低倍镜对准载物台中央通光孔(当转动到听见“咔”声响，说明物镜已与镜筒呈一直线)。将可变光阑完全打开。旋转聚光镜升降螺旋，使聚光镜上升到和载物台相平。在目镜上观察（两只眼睛都要睁开），同时用手调整反光镜角度，对好光源。要求视野达到完全均匀明亮。

(2)放置玻片标本：取蛙血涂片标本放在载物台上，有盖玻片的一面向上。玻片两端用标本夹夹住，然后转动标本推进器螺旋，使玻片上要观察的标本对准通光孔。注意，载物台上的刻度可以标示玻片的坐标位置。

(3)调节物距：转动粗调螺旋，上升载物台使低倍镜距玻片标本0.5cm 左右。注意：必须从显微镜侧面观察物镜与玻片的距离。切勿用眼在目镜上观察的同时上升载物台，以防镜头碰撞玻片造成损坏。双眼从目镜上观察，用手慢慢转动粗调螺旋下降载物台，当视野中出现物像时，再调节细调螺旋，直至视野中出现清晰的物像(许多椭圆形的红细胞)为止。如果物像不在视野中央，可用标本推进器前后、左右移动玻片位置(注意：移动玻片的方向与观察物像移动的方向恰好是相反的)。

反复练习上述各操作步骤，做到迅速熟练地找到标本，以及对光合适(即较熟练的应用反光镜、可变光阑和聚光镜)。

2. 高倍镜的使用

(1)前提是在低倍镜下找到要观察的标本物像后，并把要放大的部分移至视野正中央，同时调节到最清晰程度，才能进行高倍镜的观察。

(2)转动物镜转换器，将高倍镜转到载物台中央通光孔处。转换高倍镜时速度要慢，要细心，并从侧面进行观察(防止高倍镜碰撞玻片)。如果高倍镜碰到玻片，说明低倍镜的物距没有调节好，应重新进行操作。

(3)调节物距：转换好高倍镜后，用双眼在目镜上观察。这时物像往往不清楚或者要观察的部分不在视野正中央，可用细调螺旋慢慢向上或向下转动(切勿用粗调螺旋)即能清楚看到物像。一般只需转动半圈或一圈就能达到要求。在高倍镜下，可见蛙血红细胞呈椭圆形，外被细胞膜，膜内浅粉色为细胞质，中央有一圆形呈蓝紫色的细胞核，如图1-2所示。

图1-2蛙血涂片

3. 油镜的使用

(1)前提同样是在低倍镜下找到所要观察的标本后，把所要观察的部分移至视野正中央。

(2)转动物镜转换器，移开低倍镜，在标本上所要观察的位置加一滴镜油(香柏油)，转动物镜转换器，转换油镜，使之对准载物台中央通光孔处，浸在油滴中。

(3)转换好油镜后，用双眼在目镜上观察。物像如不清楚，可用细调螺旋慢慢向上或向下转动，即可清楚地看到物像。如仍看不清标本，需重新用低倍镜观察，然后再转换油镜。

(4)观察完标本后，用滴上二甲苯的擦镜纸擦拭干净油镜镜头，再用另一张清洁的擦镜纸盖在玻片标本上，滴上1～2滴二甲苯，轻拉擦镜纸，将玻片上的镜油擦去。注意，勿擦坏标本。

(三)低倍镜、油镜的使用练习

1. 制作血涂片 取一滴血，滴于清洁的载玻片一端，另取一张边缘平整的载玻片，按照图1-3 所示制作血涂片。先用低倍镜再用油镜进行观察，并分辨红细胞、白细胞和淋巴细胞，比较三种物镜的放大倍数和分辨率。

图1-3 血涂片的制备方法

2. 观察兔脊神经节切片（示固定染色的细胞） 取兔脊神经节切片标本先在对好光线的低倍镜下观察(固定染色的标本需调亮光线)，在低倍镜下找到要观察的标本，为淡紫色的神经节切面，其外围包有被膜，且向内伸入，形成神经节的结缔组织支架，节内有许多大小不等的神经细胞，呈散在分布。然后转换油镜，选择完整而清晰的圆形神经细胞，仔细观察其内部结构。可见细胞中央有一圆形核，核内有着色为深紫红色的圆形核仁及染色质颗粒，核与细胞膜之间是均匀浅紫色的细胞质，在细胞的外面围有若干个被囊细胞，它起保护神经细胞的作用。在神经细胞之间还可看到轴索横断面和许多神经纤维，多呈交错排列。

(四)其他几种显微镜简介

目前，在生物学和医学领域中，常用的显微镜还有以下几种：

1. 倒置显微镜 结构组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞的生长情况，具有相差物镜。倒置显微镜和放大镜起着同样的作用，就是把近处的微小物体显示成一放大的像，以供人眼观察。只是显微镜比放大镜可以具有更高的放大率而已。

2. 摄影显微镜 现代高质量显微镜均可安装显微照相的各种附件，可以及时完整地保留科学资料。用于照相的显微镜要求光学系统和机件结构精密，镜体坚固稳定。自动曝光显微照相装置具有自动卷片，自动测光、自动控制曝光，测量和调整色温以及互易律失效的补偿等各项功能，均用电子计算机自动控制，可以进行黑白感光片、彩色负片和彩色幻灯片的投照。

3. 暗视野显微镜 是一种具有暗视集中器或中央遮光板的显微镜。即在普通光学显微镜的载物台下配置一个暗视野聚光器，下方光源的光线被抛物面聚光器反射，形成了横过显微镜视野而不进入物镜的强烈光束。因此视野是暗的，视野中直径大于0.3m 的微粒将光线散射，其大小和形态可清楚看到。甚至可看到普通明视野显微镜中看不见的几个纳米的微粒。因此在某些细菌、细胞等活体检查中常常使用，这种显微镜可观察运动着的有机体。

4. 相差显微镜 又称位相显微镜或相衬显微镜。普通光学显微镜看不见未染色的组织、细胞和细菌、病毒等活机体的图像，是因为通过样品的光线变化差别(反差)很小。标本染色后改变了振幅(亮度)和波长(颜色)，影响了反差而获得图像。但是染色会引起样品变形，也可使有生命的机体死亡。要观察不染色的新鲜组织、细胞或其他微小活体必须使用相差显微镜。相差显微镜是在聚光器下装一个环状光阑，其物镜是装有相板的相差物镜。环状光阑的作用是造成空心的光线锥，使直射光和衍射光分离。相板的作用是使直射光和衍射光发生干涉，导致相位差变成振幅差(即明暗差)，使反差加强，利用样品中质点折射率的不同或质点厚度的不等，产生光线的相位差，使新鲜标本不必染色就可以看到，而且能够观察到活细胞内线粒体及染色

体等精细结构，还可以应用于霉菌、细菌、病毒等更微小活体的研究，进行标本形态、数量、活动及分裂、繁殖等生物学行为观察。

5. 荧光显微镜 其特点是以紫外光为光源，利用紫外光照射，使标本内的荧光物质激发出不同颜色的荧光，以研究标本内某些物质的位置和特征。有些物质本身能发出荧光，但大部分物质须经荧光染料(如吖啶橙、异硫氰酸荧光素等)染色后才能发出荧光。荧光显微镜的特点是灵敏度高，在暗视野中低浓度荧光染色即可显示出标本内样品的存在，其对比约为可见光显微镜的100 倍。20 世纪30 年代荧光染色即已用于细菌、霉菌等微生物及细胞、纤维等的形态观察和研究，如用抗酸菌荧光染色法可帮助在痰中找到结核杆菌。20 世纪40 年代创造了荧光染料标记蛋白质的技术，这种技术现已广泛应用于免疫荧光抗体染色的常规技术中，可检查和定位病毒、细菌、霉菌、原虫、寄生虫及动物和人的组织抗原与抗体；可用以探讨病因及发病机理，如肾小球疾病的分类及诊断，乳头瘤病毒与子宫颈癌的关系等。在医学实验研究及疾病诊断方面的用途日益广泛。

6. 电子显微镜 光学显微镜的分辨本领由于所用光波的波长而受到限制。小于光波波长的物体因衍射而不能成像。最高级的光学显微镜的分辨本领限度约200nm。为了突破这一限度，可采用电子射线来代替光波。电子微粒高速运动时，其行为类似光波的传播过程。运动电子的波长随其速度而定，在增压达50 万伏时，其波长为0.001nm，即电子射线的波长约为可见光的十万分之一，其放大倍数比最高级的光学显微镜要高很多。以电子射线为电子光源的显微镜称为电子显微镜。现代医学和生物学使用的电镜分辨率为5～10nm，即放大率为10万～20万倍。

【注意事项】

(1)持镜时要一手紧握镜臂，另一手托住镜座，以防目镜从镜筒滑出或反光镜脱落。

(2)轻拿轻放，不要把显微镜放在实验台边缘，防止碰翻落地。

(3)显微镜光学系统部件要用清洁的擦镜纸轻轻揩擦，切勿口吹、手抹或用粗布揩擦。

(4)使用时先用低倍镜调整光线。观察活体标本或染色较浅的标本时，要适当关小可变光阑使视野变暗，方能看得清楚。

(5)放置玻片标本时要对准载物台中央通光孔，并且不能将玻片放反了，如标本玻片放反时油镜下看不到物像，并容易压坏玻片或物镜。

(6)观察时要双眼睁开，切勿闭上一只眼睛。

医学细胞生物学与遗传学实验教学是培养现代创新型医学人才的重要环节。在本次教材修订过程中，编写组继承上一版实验教材的编写特点和基本框架。特别是增加医学细胞生物学和医学遗传学教学配套用学习自测题。自测题由教学经验丰富的教师以教学大纲为依据，以规划教材为蓝本，参考医师资格考试内容，按科学性、系统性、先进性的要求编写而成。每一章都有重点难点提要和自测题。自测题包括选择题、名词解释、简答题和论述题四种题型，有些章节有病例分析。每章后附有参考答案，便于学生自测。