法医DNA分析操作指南

目录

**章DNA分析的样本采集1

1.1引言1

1.2检材分类、定位和鉴定准备2

1.3检材提取5

1.4记录保存、包装和存储8

1.5注释9

免责声明11

参考文献11

第二章利用mRNA分型进行体液识别14

2.1引言14

2.2材料19

2.3方法22

2.4注释32

参考文献33

第三章阴道液和月经期血液鉴定的mRNA分型35

3.1引言35

3.2材料37

3.3方法39

3.4注释42

致谢44

参考文献44

第四章肌肉组织的保存和DNA提取46

4.1引言46

4.2材料50

4.3方法52

4.4注释55

致谢57

参考文献57

第五章DNA提取：有机相和固相59

5.1引言59

5.2有机萃取（苯酚氯仿）60

5.3固相核酸提取法63

5.4基于AutoMate ExpressTM仪器的PrepFiler ExpressTM和Express BTATM法医DNA提取试剂盒66

5.5注释69

参考文献71

第六章骨骼DNA提取73

6.1引言73

6.2材料75

6.3方法79

6.4注释89

致谢93

免责声明93

参考文献94

第七章人类骨骼材料的DNA提取95

7.1引言95

7.2材料99

7.3方法101

7.4注释113

致谢114

参考文献114

第八章用于法医DNA分析的扩增内标（IAC）和DNA分型试剂盒的发展和使用119

8.1引言119

8.2材料123

8.3方法125

8.4注释133

参考文献135

第九章NucleoSpin XS吸附柱用于DNA浓缩和纯化137

9.1引言137

9.2材料138

9.3方法138

9.4注释141

参考文献141

第十章纯化PCR产物提高STR分型率143

10.1引言143

10.2材料144

10.3方法145

10.4注释146

参考文献146

第十一章使用Investigator DIPplex试剂盒分析30个InDel二等位基因标记147

11.1引言147

11.2材料150

11.3方法151

11.4注释153

参考文献155

第十二章用桑格测序法分析线粒体DNA控制区157

12.1引言157

12.2材料159

12.3方法160

12.4注释168

参考文献169

第十三章人类线粒体DNA全测序171

13.1引言171

13.2材料173

13.3方法177

13.4注释184

致谢185

参考文献185

第十四章液相杂交技术在线粒体全基因组靶向富集中的应用187

14.1引言187

14.2材料188

14.3方法192

14.4注释197

参考文献198

第十五章利用Y染色体靶向预扩增和二代测序技术提升延长间隔性交后样本中精子供体的DNA分型图谱200

15.1引言200

15.2材料205

15.3方法207

15.4注释213

参考文献216

第十六章Y染色体快速突变短串联重复序列（RM YSTR）分析218

16.1引言218

16.2材料221

16.3方法222

16.4注释226

参考文献229

第十七章HIrisPlex系统实用指南：通过DNA同时预测眼睛和头发

颜色231

17.1引言231

17.2材料233

17.3基因分型方法237

17.4注释242

致谢248

参考文献248

第十八章法医分析中的祖先推断一：常染色体祖先信息标记集251

18.1引言251

18.2材料253

18.3方法254

18.4注释269

参考文献271

第十九章法医分析中的祖先推断二：遗传数据分析274

19.1引言274

19.2材料276

19.3方法277

19.4注释297

参考文献306

第二十章种属确定：细胞色素b基因的功能与应用308

20.1引言308

20.2材料310

20.3方法311

20.4注释314

参考文献317

**章 DNA分析的样本采集

Roland A. H. van Oorschot，Timothy J. Verdon和Kaye N. Ballantyne

摘要：生物检材的有效提取对于获取具有证据价值的DNA图谱至关重要。检材提取方法主要有擦拭、剥离或剪切。本章介绍了在应用这些方法时需要考虑的主要因素，以及擦拭和胶带剥离的建议步骤；并论述了检材采集过程中涉及的一些重要问题，如检材分类、鉴定准备、污染风险、检材定位、检材鉴定、鉴定顺序以及记录保存、包装和储存等问题。

关键词： 检材提取，检材定位，污染风险，拭子，胶带提取，法医

1.1 引言

用于脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）分析的生物检材的采集不仅仅是使用拭子擦拭明显污渍，然后将其放入试管，再进行DNA分析这么简单。确定需要采集的检材类型以及有效的提取方法也是DNA分析过程中的关键问题。错误或不完整的检材定位和提取将使生成的DNA图谱质量及其证据价值都大打折扣，并*终限制其在司法鉴定中的贡献。

围绕DNA证据采集的问题远不止于生物检材的鉴定和提取方法。鉴定人员必须认识到，相对于其他法医学鉴定，DNA鉴定的时间是相互影响的，在检材提取/鉴定以及记录保存、包装和储存之前或期间存在污染风险，在检材提取前需要进行推定和确证测试。

本章将重点介绍对用于DNA分析的生物检材的主要提取方法，包括整体载体提取、部分载体剪切、拭子擦拭和胶带剥离（见注释1）；提供了关于法医物证鉴定和回收的其他因素信息，以使读者充分理解检材采集工作的复杂性。需要注意的是，在检材提取领域进行的实证研究相对较少，因此许多常见做法都是基于假设、传闻或从业者的经验，而非基于确认、质控和测试数据。本章将为读者列举能够获取此类数据的相关参考资料。

1.2 检材分类、定位和鉴定准备

1.2.1 多学科取证

对于许多犯罪现场或物证来说，DNA并不是法医调查可用或需要的唯一证据。然而，生物检材的发现和提取可能会影响其他证据的获取。例如，它可能会去除其他形式的痕迹物证（如纤维、玻璃或植物材料）、抹去压痕或文字、损坏电子设备、去除或掩盖指纹和工具痕迹，并使得损伤和血型分析复杂化。因此，在进行任何检验之前，应与送检人及其他相关法医学科专家进行适当沟通。基于所需的鉴定类型来确定证据采集的相对顺序，而这一顺序可能具有高度的个案针对性。一般来说，采用“痕迹物证优先策略”（如微量DNA、枪击残留物或纤维）可能有助于防止因过度处理或操作而污染或丢失微量或容易转移的证据。

在考虑鉴定的相对顺序时，不仅要考虑DNA分析对其他鉴定的影响，还要考虑其他鉴定对潜在DNA证据的影响。例如，由于存在检材被移除［1］或目标区域被污染［1，2］的潜在风险，使用指纹刷和指纹粉进行指纹可视化处理可能会降低从指纹中获取DNA图谱的概率（无论该指纹是否提供证据价值）。一些指纹鉴定方法甚至会抑制DNA分析过程［3～7］。使用静电检测仪（electrostatic detection apparatus，ESDA）对枪痕或枪柄进行提取，可能会去除物品上存在的大量DNA。

1.2.2 污染风险

在检材提取和鉴定过程中尽量减少污染风险对于保存DNA证据的完整性至关重要。PowerPlex ESI/X和GlobalFiler等二代检验试剂盒具有极高的灵敏度，甚至可以检测到微小的背景痕迹或污染物。因此，必须制定严格的法医物证检验程序以防止证据的丢失或污染。

检材进行DNA鉴定之前的其他检测时，应采用与DNA鉴定相同等级的污染风险降低程序。也有人建议，在检材的DNA后检测过程中，也应该采用这些程序，以便在需要复检或再鉴定时保持检材的完整性。

案件现场提取检材时，应尽快做好检材周边区域的安全防护并限制出入；实验室提取检材时，检验区域应隔离或半隔离，减少人员流动，检验台面气流应接近中性。

无论是案件现场还是实验室，任何进入检验区的人员都应提前穿戴全套防护装备，包括工作服、口罩、帽子和一次性手套。这些防护装备可以保护检材免受工作人员或其他人员生物样本的影响（例如，说话/咳嗽的唾液、脱落的毛发、衣服上脱落的皮肤细胞、皮肤上的油脂/脱落DNA）。手套是*有可能接触到检材的防护设备，必须经去核酸处理。从包装中取出手套时应防止手套与裸手/皮肤（尤其是新手套的手指和手掌部位）或潜在的污染表面（如手套盒外部）接触。双层手套的做法，即在**层手套上再戴一层手套，可进一步降低污染风险。

另外，还需注意穿戴防护服的顺序，应先戴帽子和口罩（以防止头发/唾液等掉落至工作服上），然后穿工作服，*后戴手套，确保手套覆盖手腕和前臂，并戴过工作服袖口。

确保环境洁净并将污染风险降至*低，在实验室检验区仅放置特定工作所**的工具和设备。每次使用前后所有设备及台面均应彻底清洁。将物品分为高、中、低风险，有助于提高对污染概率的认知，并确保对每件物品采取适当的清洁措施。高风险物品是指有可能直接接触检材的物品（如镊子、剪刀、手套等）；中风险物品包括可能作为非检材表面与检材之间的一步载体（如手套盒、笔、放大灯、滴管等）［8，9］；低风险物品是指需要多个转移步骤才能将DNA转移到检材表面的物品（通常涉及中、高风险载体）。检材提取中使用的工作台和设备的所有表面应定期清洁、每次使用前后清洁，并将重点放在高、中风险物品上。清洁剂应具有足够清洁强度以确保将DNA从物品表面完全清除，以防止目标DNA的转移和破坏［10］。常用试剂/方法包括次氯酸钠（0.5%～10% v/v溶液［11，12］）、紫外线［13］和环氧乙烷［14］，除此之外还有许多其他商业试剂可用。剪刀、镊子和架子等建议使用一次性、经认证的无DNA物品，当然，没有任何一种清洁方法100%有效，因此需要格外谨慎。检材和清洁工具应存放在指定的单*区域，远离潜在的污染物品，如检材包装、文书工作和生物危废/垃圾。应确保污染物品的摆放位置即使在检验期间使用它们，亦不会在样本上方有任何移动轨迹。

在整个检验过程中，应定期更换手套，特别是在接触检材（以防止将DNA从检材转移到实验室表面）或可能污染的中、低风险物品（如实验室家具、文书和包装）后。同理，如条件允许，应使用不同工具处理不同污渍——使用处理过血渍的镊子或剪刀继续处理痕迹物证很可能会造成两种污渍的人为混合［8，15］。

在处理检材时，应尽可能减少操作，并尽量避开潜在的目标提取区域。

做到以下两点，可追踪潜在污染源： 1） 记录每个案件/检材由谁，何时，使用哪些工作台、工具和设备完成检验；2） 建立实验室所有相关人员的DNA数据库。

1.2.3 检材定位与排序

基于调查需求，应明确定义检材提取区域，根据案件背景假定个体识别相关（或不相关）的污渍和痕迹区域。可视化或增强技术，如替代光源［16～18］和/或近红外摄像机［19］可辅助潜在生物检材的定位。在DNA分析的检材提取之前，可以使用推定或确征测试排除不相关污渍、筛选优先提取区域。如条件允许，应采用不接触潜在提取区域的测试或方法，*大限度地减少损失和污染检材的风险（见注释2）。

检材提取的排序应基于：1）*有可能提供相关信息的检材（如生物样本类型、数量、年龄、位置）；2）痕迹物证优先原则（此类样本*容易被污染）；3）特定体积或尺寸的生物检材可能产生的DNA含量，以及载体类型和检材提取方法的提取效率（见注释3）。

可能需要对污渍或载体进行剪切，并单*提取，以防止检材混合或扩散。导致检材混合的错误示例，如将刀柄和刀刃一起擦拭；在很多情况下，这样做可能会使受害者和犯罪者的DNA混合，并且混淆了每个个体在物品上位置的正确归属。将微量检材扩散到目标区域以外也会降低回收率，从而降低获取具有证据价值的检材概率。

此外，必须考虑到司法机构或实验室对每个案件类型或检材数量的具体要求、由*立实验室进行再鉴定的可能性、或在进一步调查后重新检验的潜在需求。

1.3 检材提取

1.3.1 提取方法选择

检材提取方法或装置的选择很大程度上取决于检材的类型和尺寸、需要提取的表面以及目标沉积物的位置。包括：

（1）直接提取法：切割部分载体（如纺织物）或使用整件物品（如弹壳［20］）。

（2）拭子擦拭法：主要用于从无孔表面提取生物检材，如刀刃和刀柄、瓶子、马克杯、手表、陶瓷等，见1.3.2节。

（3）胶带剥离法：主要用于从多孔表面（大多数纺织物材质）提取生物检材，如衣物、床上用品等，见1.3.3节。

由于载体类型或尺寸限制，使得特定DNA提取方法有其相匹配的提取设备，因此了解实验室中可用、*选的DNA提取方法非常重要。

检材提取方法的选取和检材或物品的保存应考虑到提取DNA的潜在数量和质量。例如，如果用棉签擦拭衣服上的血迹就可以获得足量DNA，那么切除部分血迹可能会对检材所有者造成不必要的损害，甚至会使后续检验复杂化。

1.3.2 拭子擦拭法

很多实验室通过拭子擦拭法提取生物检材时往往在所有应用场景中都使用同一种拭子（*常见的是棉签）［22］。但事实上，用于生物检材提取的拭子类型有很多种，在很多情况下，根据载体类型选用不同拭子非常必要（尽管这种特定情况的组合数据还不够完善）［21］。关于从不同类型载体上提取不同形式生物证据时拭子的选取建议见表1.1。拭子法擦拭时建议采用以下步骤，以提取*大数量的生物检材。

表1.1 建议的拭子类型。已有证据表明可从不同载体中有效提取各种形式的生物证据［21］

《法医DNA分析操作指南》系统介绍了一系列的法医DNA分析方法和*新进展，深入讨论了DNA分析过程可能涉及的所有操作步骤、潜在问题以及应对措施，详细描述了DNA分析在法医鉴定中的应用类型。《法医DNA分析操作指南》共20章，系统介绍了以下三方面内容：DNA分析的操作流程（第1章，第4~10章），包括生物样本的采集、运送、储存、DNA提取、PCR反应、毛细管电泳及图谱分析等；DNA分析的技术手段（第11~16章），包括STR、SNP、InDel、Y-STR和线粒体DNA等分型方法；DNA分析的法医应用（第2~3章，第17~20章），包括个体识别、体液识别、祖先信息推断、表型画像等。